שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח לגבי התפקיד של ארסים חוץ תאיים ב vivo, על ידי מתן לנו מקור של ארסים המייצגים את microenvironment רקמה מקומית. מחקרים על ורים חוץ-תאיים בתוך המילייה הרקמה יכולים לקדם את הבנתנו את התפקידים הפיזיולוגיים של ורים חוץ-תאיים ואת שינויים בתהליכים פתופיזיולוגיים ב-vivo. הדגמה חזותית של cannulation וריד הפורטל הוא מועיל כמו גודל קטן של וריד מקשה להפוך מניפולציה.
הדגמת ההליך עם ד"ר קאורי אישיגורו תהיה איירין יאן, טכנולוג מחקר מהמעבדה שלי. לפני תחילת ההליך, לאבטח את הגפיים של עכבר הרדמה ולחבר את המחט 23 מד של איסוף דם מכונף להגדיר לקצה החופשי של חתיכת צינור משאבת מזרק. לנקות את עור הבטן של העכבר עם 70% אתנול כרית אלכוהול ולהשתמש מספריים כדי לפתוח את העכבר מן החלק העליון של החזה לעצם האגן, דואג לא לפגוע באיברים פנימיים.
השתמשו במוליך כותנה כדי להזיז בעדינות את המעיים לצד ימין של חלל הבטן כדי לחשוף את וריד הפורטל ואת וריד הובנה קאווה הנחות ולהשתמש במטליות מעוגלים כדי למקם חוט מתחת לווריד הפורטל. לקשור קשר באופן רופף בתפר כדי להתכונן cinching לאחר cannulation ולמלא את cannula עם 40 מעלות צלזיוס HBSS עד הפתרון מגיע קצה מחט קנולה. הכנס את ה Cannula לתוך וריד הפורטל חמישה עד 10 מילימטרים מתחת קשירה ולאבטח את cannula עם התפר.
התחל את העירוי בקצב זרימה של 1-2 מיליליטר לדקה. אם ה Cannula היה ממוקם כראוי, הכבד יתחיל blanche. חותכים את וינה קאווה נחותה ולאפשר את הנוזל המוגזם בתוך הכבד לנקז.
לאט להגדיל את קצב הזרימה לשמונה מיליליטר לדקה עד מלא 50 מיליליטר של HBSS כבר חדור דרך הכבד במהלך חמש הדקות הבאות. רגע לפני שנגמר HBSS, לשנות טרי מוכן 40 מעלות צלזיוס קולגנס ארבע פתרון למזנון perfusate ולהשתמש מלקחיים כדי להפעיל לחץ חולף על ונקווה קאווה נחותה במרווחים של חמש שניות כדי לגרום לכבד להתנפח ולעזור עם עיכול רקמות דיסוציאציה. ככל שהעיכול מתקדם, הכבד יתנפח ויהפוך ללבן.
כאשר השרידים מדוכאים לאחר בירור עדין עם מוליך כותנה, לעצור את המשאבה ולהסיר את cannula. הסר את כיס המרה מהכבד, נזהר לא לקרוע את רקמת כיס המרה, ולהשתמש מספריים נקיים ממטרים כדי לקצור את הכבד לתוך צלחת תרבות סטרילית 10 ס"מ של PBS. לאחר שטיפה עדינה, מעבירים את הכבד לתבשיל תרבות חדש באורך 10 ס"מ המכיל קולגן טרי ארבע תווי בית ולהשתמש בשני ממטרים נקיים כדי לקרוע את הכבד תוך כדי רעידות עדינות כדי לנתק את התאים מרמת הכבד.
כאשר האיבר כולו כבר מקוטע, להשתמש מזרק שלושה מיליליטר כדי triturate תרחיף הרקמה עד חתיכות מעוכל של הכבד מזועזעים. יוצקים את פתרון התא וכתוצאה מכך דרך מסננת רשת ניילון 70 מיקרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, לשטוף את המנה עם HBSS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. בריכה לשטוף עם ההשעיה תא יחיד ולהסיר את hepatocytes על ידי צנטריפוגה.
ואז להעביר את supernatant לצינור חדש 50 מיליליטר. כדי להסיר את כל התאים האחרים, צנטריפוגה supernatant לפני העברה לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר. הסר את התאים המתים עם צנטריפוגה אחרת ולהעביר את supernatant לתוך צינור תחתון עגול כדי להסיר את כל פסולת התא אגרגטים.
עכשיו להעביר את supernatant לתוך צינור פוליקרבונט אולטרה צנטריפוגה ולתלות את גלולה על 20 מיליליטר של PBS עבור צנטריפוגה אולטרה שנייה ואחרונה. ואז resuspend גלולת nanovesicle חוץ תאית במיליליטר אחד של PBS עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס אם הווסקולים לא ינותח מיד. מכבד עכבר יחיד, שיטה זו מניבה ריכוז דם חוץ-תאי של רקמה שטווחו בין 1.74 ל-4 פעמים 10 עד השנים-עשר עם ממוצע של 3.46 פעמים 10 לחלקיקים השתים עשרה למיליליטר כפי שנקבע על ידי ניתוח מעקב חלקיקים.
הגודל הממוצע של רקמת הכבד המבודדת דם חוץ תאי הוא 157.7 ננומטר עם גודל מצב של 144.5 ננומטר וגדלים חוץ תאיים של וריקולים הנעים בין 100 ל -600 ננומטר על ידי ניתוח מעקב חלקיקים. הווסקולרים החוץ-תאיים המבודדים באמצעות גישה זו מתאימים ליישומים במורד הזרם והאפיון הנוסף עשוי לכלול הערכות מורפולוגיות על ידי אלקטרומיקרוסקופיה או ניתוח של סמני פני השטח או התוכן שלהם.
