כדי לצפות לוקליזציה תת-תאית של GFP, לאחר 48 שעות של חדירה חקלאית של ניקוטיאנה בנתמיאנה, בחר עלה שטוח ועשה חור של שישה מילימטר באמצעות ניקוב חור. טפטפו תמיסת 30% סוכרוז על מגלשת זכוכית. מניחים את דוגמת העלה כשהגב פונה כלפי מעלה, ומכסים אותה בכוס כיסוי.
אספו את עלי N.benthamiana השלמים והטריים המבטאים GFP רקומביננטי שלושה ימים לאחר ההסתננות, ושקלו את העלים. שטפו את להב העלה במים מקוררים, מעוקרים ומזוקקים פעמיים כדי להסיר לכלוך. יש לטבול 20 גרם עם הצד האבקסיאלי כלפי מטה ב-500 מיליליטר של חיץ פוספט מקורר מראש של 100 מיליליטר בכד בעל פה רחב של 1,000 מיליליטר.
מכסים את העלים ב-100 ניילון רשת, חוט רשת דק וצלחת פלסטיק. חברו את הכד למשאבת ואקום. החל שואב אבק 0.8 מגה-פסקל למשך דקה אחת, ולאחר מכן שחזר במהירות ללחץ אטמוספרי.
מוציאים את העלים מהמאגר ומייבשים בעדינות עם נייר סופג. מגלגלים את העלים ועוטפים אותם בחוט רשת. לאיסוף נוזל כביסה אפופלסטי, או AWF, מקמו עלים מגולגלים בקצה הצד בצינורות צנטריפוגות 50 מיליליטר עם חוט רשת המהודק על ידי מכסי הצינורות.
צנטריפוגו את העלים ב 500 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את העלים ואוספים AWF בעזרת פיפטה. הוסף ניקל Sepharose excel שרף לצינור ביחס של אחד ל -1, 000 ביחס לנפח תמצית החלבון.
שטפו את שרף הניקל שלוש פעמים עם נפח שרף גדול פי 10 מזה של מים מזוקקים פעמיים וחיץ פוספט בנפרד, בתורו. יש לדגור על תמצית חלבון עם שרף ניקל למשך שעתיים כדי לאפשר קשירה מלאה. לאחר מכן, צנטריפוגה במשקל 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר חלבונים לא קשורים בסופרנטנט.
יש לשטוף שלוש פעמים בנפח שרף גדול פי 20 מזה של חיץ פוספט. לאחר השטיפה האחרונה, מוסיפים פי 10 מנפח השרף של 250 מילימולר אימידזול כדי להליט GFPs. צנטריפוגו את התערובת ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואספו את הסופרנטנט.
ניתוח כתמים מערביים אישר את הביטוי הארעי של חלבון רקומביננטי 30 קילודלטון GFPs ב- N.benthamiana. מיקרוסקופ פלואורסצנטי המחיש את נוכחותם של GFPs בתוך האפופלסט. חלבוני AWF שחולצו על ידי צנטריפוגת חדירת ואקום הכילו גם GFPs.
מתוך שמונה פתרונות המיצוי שנבדקו, חיץ פוספט חילץ את הכמות הגדולה ביותר של AWF ו-GFPs. השוואת חיץ פוספט ברמות pH משתנות חשפה מיצוי משופר של AWF ו-GFPs בתנאים ניטרליים עד בסיסיים קלים. בנוסף, חיץ פוספט של 100 מילימולר הראה יעילות מרבית לשחזור AWF ו-GFPs.
עם חיץ פוספט של 100 מילימולרי, 495 מיקרוגרם של חלבוני AWF כוללים לגרם של עלה טרי נמצאו מהאפופלסט. ה-AWF המופק הכיל 10 מיקרוגרם של GFPs, אשר התאימו לכ-18% מה-GFPs בסך החלבון המסיס. בעקבות כרומטוגרפיית זיקה לניקל, טוהר ה-GFPs הגיע ל-84.3% ממיצוי AWF, גבוה משמעותית מהטוהר של 44.9% שהושג באמצעות מיצוי חלבון מסיס כולל.
