לאחר ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמות FFPE, צלם את הקטעים באמצעות הדמיית הפתולוגיה הדיגיטלית. הפעל את התוכנה כדי לבצע ערבוב ספקטרלי של התמונות המבוארות. בחר קובץ, ולאחר מכן לחץ על פתח תמונה ובחר את קבצי QPTIFF כדי להעלות את התמונות לתוכנה.
אפשר להעלות את החותמות המסומנות כפרויקטים מושכלים לפרויקט. טען את קבצי QPTIFF שהוכנו לפיצוי autofluorescence. בחרו באוטופלואורסצנטיות בכלי התמונה כדי לצייר קו על התמונה מהשקופית הלא מוכתמת דרך מבנים אוטופלואורסצנטיים כמו אריתרוציטים וקולגן כדי לפצות על אוטופלואורסצנטיות.
לאחר מכן נווטו אל המקטע עריכת סמנים וצבעים. הקצה שמות סמנים התואמים לאופל פלואורופור, והתאם את הגדרות הצבע לאפשרות המועדפת עליך. בחר הכן הכל הממוקם בפינה השמאלית התחתונה של הממשק כדי ליזום את ביטול הערבוב של פלואורופורים.
בדוק את כל התמונות כדי לבדוק את הנראות של כל האותות ואת ההשלמה המוצלחת של תהליך unmixing. בחר את סמל גלגל העין כדי לכבות ולהפעיל את כל הסמנים בזה אחר זה כדי לבדוק את האיכות. כעת נווט אל יצוא הכרטיסייה וצור ספריית ייצוא ריקה חדשה על ידי לחיצה על לדפדף כפתור הממוקם מתחת לספריית הייצוא.
בחרו TIFF של תמונות ללא הפרדות צבע ותמונות הנרכיבות רכיבים תמונות מרובות תחת הכרטיסייה 'תמונות לייצוא'. נווט אל הכרטיסייה ניתוח אצווה הממוקמת אנכית משמאל לעיבוד אצווה של שקופיות ובחר צור ספריות נפרדות לכל פריט תחת אפשרויות הייצוא. כדי להוסיף שקופיות לניתוח, בחר קבצי QPTIFF תחת לחצן הוסף שקופיות וטען אותם לניתוח האצווה.
בחר הפעל כדי להתחיל את עיבוד האצווה של שקופיות. צור תיקייה חדשה שתכלול רק את הקבצים המרכיבים רכיבים מביטול ערבוב ספקטרלי, כדי להבטיח שמבנה התיקיות ההיררכי יישאר ללא שינוי. הפעל את תוכנת מציג השקופיות כולה.
לחץ על צור פרוייקט בצד ימין וצור או בחר תיקיה ריקה חדשה בשם המתאים. לאחר מכן לחץ על אוטומציה ובחר הצג עורך סקריפטים. העתק והדבק את קובץ ה- Script הקיים ושנה את המיקום כדי לכוון אותו לעבר התיקיה המכילה את כל קבצי רכיבי השקופיות.
בחר הפעל כדי להתחיל את התהליך של תפירת שקופיות אצווה ולאחר מכן אפשר לו להשלים. כעת העבר את קבצי OME TIFF שנוצרו לאחרונה לפרוייקט QuPath ושמור אותם כפרוייקט חדש. כשמופיע חלון חדש, בחר/י ״הגדר סוג תמונה כפלואורסצנטי״ ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״ייבוא״.
נווט לתפריט משמאל, בחר מדגם מהרשימה ולחץ פעמיים כדי לפתוח את המדגם שנבחר. התאימו את עוצמת הערוצים בלחיצה על סמל הניגודיות כדי לשפר את הניראות. בחר את כל הערוצים ובחר לאפס.
ודא שהאוטופלואורסצנטיות כבויה. כדי לצייר אזור עניין או החזר השקעה עבור הגידול, לחץ שוב על סמל הניגודיות ולאחר מכן בחר הצג גווני אפור. לאחר מכן, בחר את ערוץ סמן הגידול והתאם את העוצמה לנראות אופטימלית.
לחצו על כלי המברשת כדי לצייר החזר השקעה סביב הגידול. לחץ על הכלי האחד והתאם את החזר ההשקעה תוך כדי לחיצה על מקש alt כדי להחליק את החזר ההשקעה מבחוץ. בסיום, מזג את כל החלקים המופרדים של הגידול לאותו החזר השקעה.
לחץ לחיצה ימנית על ביאור החזר ההשקעה ברשימה משמאל, בחר הגדר מאפיינים וספק שם מתאים. למשל, גידול. הרחב את החזר ההשקעה עבור השוליים הפולשניים מאזור הגידול על-ידי בחירה באפשרות אובייקטים, לאחר מכן ביאורים, ולאחר מכן הרחב ביאורים.
בחר את הגודל הרצוי עבור רדיוס ההרחבה. בחר הסר פנים והגבל להורה. לחץ על סמל הניגודיות, בחר את ערוץ הפלואורסצנטיות האוטומטית והתאם את העוצמה לנראות אופטימלית.
לחץ על השרביט והתאם את החזר ההשקעה תוך כדי לחיצה על מקש alt כדי להחליק את החזר ההשקעה מבחוץ ולהסיר כל רקע שלא אמור להיות חלק מהחזר השקעה זה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הביאור ברשימה מימין. לאחר מכן בחר הגדר מאפיינים כדי להקצות שם מתאים, כגון שוליים פולשניים או הודעות מיידיות ל- ROI.
אם תרצה, שנה את צבעו. כדי לייצא את הביאורים, נווט אל האפשרות קובץ, לחץ על נתוני אובייקט, יצא כ- GeoJSON ובחר יצא את כל האובייקטים. המשך עם בחירת ברירת המחדל בייצוא כאוסף תכונות, ושמור אותה במיקום מועדף.
