כדי להתחיל, הגדר מיקרוסקופ פלואורסצנטי להדמיה. הכנס שקופית מוכתמת במלואה עם קטעי רקמת כתמים חיסוניים. לאחר הגדרת המטרה, לחץ על הלחצן החי ולאחר מכן התמקד בדגימה.
השתמש בסמל קנה מידה אוטומטי כדי להעריך אם הערוצים רוויים במידה מספקת באות. לאחר השלמת הגדרות המיקרוסקופ, טען את המיקרוסקופ בשקופיות בקרת הצבע היחיד. התמקד מתחת לדוגמה ולחץ על האפשרות התחל בתפריט Z-Stack כדי להתחיל בהגדרת Z-Stack.
לאחר מכן התמקד מעל הדגימה ולחץ על אפשרות הסיום. לפיצוי פלואורסצנטי של התמונות, פתח אחת מתמונות הבקרה היחידה. התבונן בחלונות בקנה מידה אפור עבור כל ערוץ עבור אות בערוץ לא הולם.
כדי להסיר את הגלישה דרך, הזן ידנית מספרים במטריצה ולאחר מכן לחץ על החל כדי לבדוק אם הוא הוסר כראוי. לאחר מכן, הרכיב את כל הערכים מכל פקד למטריצה אחת. החל מטריצה זו על דגימה מוכתמת במלואה.
הפעל את תוכנת ilastik ופתח את קובץ tiff של הרקמות. לחצו על כרטיסיית האימון ולאחר מכן השתמשו בכלי מברשת הצבע כדי לסמן תאים בודדים בתמונות. הקפד להדגיש את התאים כך שהחלק הפנימי וקרום התא כלולים.
לאחר מכן, השתמש בתווית שתיים כדי להדגיש את כל מה שאינו התאים המעניינים. כעת הפעל את תוכנה שלוש ופתח תמונת IMS של הרקמה המכילה את כל הכתמים הפלואורסצנטיים. בחרו באפשרות 'מסיכה על גרעינים' כערוץ המקור לזיהוי גרעינים.
לאחר מכן בחר באפשרות המתקדמת לפיצול גרעינים לפי נקודות זרע. הגדר ערך לקוטר הגרעין. בדוק אם התמונה מכילה תאים מרובים או תאים חסרים.
לאחר מכן לחץ על אובייקט התאים שנוצר, ואחריו על הכרטיסייה יצירה, ולאחר מכן את הפרמטרים לאחסן עבור אצווה אפשרות לשמור את הגדרות השימוש. הפעל את אנקונדה ואז הפעל את JupyterLab בתוך אנקונדה. פתח את קובץ הקידוד המשלים 1 ולאחר מכן לחץ על הפעל את כל התאים או הפעל תאים שנבחרו בתפריט הפעלה.
כאשר מופיעה הנחיה, הזן את ספריית הקבצים עבור הערכים הפלואורסצנטיים המיוצאים. לאחר מכן הזן את ספריית הקבצים עבור כל מיקום המתאים לשמירת הקבצים המעובדים. הפעל את המקטע הבא של הקוד כדי להוסיף ביאורים לנתונים עם השמות של כל ערוץ.
לאחר קביעת אסטרטגיית gating, לחץ לחיצה ימנית על האוכלוסייה בתפריט, ולאחר מכן בחר ייצוא. יצא את הפרמטרים כקובץ csv עם הכותרות כלולות. הפעל שוב את JupyterLab באנקונדה.
לאחר מכן פתח את הסקריפט בקובץ קידוד משלים 2 והפעל את הקוד. כאשר תתבקש להזין את מיקום התוכנה עבור קובץ, הזן את ספריית הקבצים של קבצי ה- csv המיוצאים. לאחר מכן, כאשר תתבקש להוסיף את מיקום הפלט, בחר ספריית קבצים לפי בחירה וודא שספריית הקבצים כוללת את שם הקובץ בסוף.
הפעל את שאר הקוד. עכשיו להעתיק את הטקסט בקובץ txt ולפתוח את קובץ ims המתאים בתוכנה שלוש. לחץ על אובייקט התא בקובץ.
עבור לכרטיסייה סטטיסטיקה ולאחר מכן הדבק את הטקסט בסרגל החיפוש והתחל בחיפוש. כל התאים המעניינים יודגשו כעת. צבעים פלואורסצנטיים חופפים באופן ספקטרלי הופרדו ביעילות ברקמה שהוכתמה בצבעים מרובים.
ההפרדה של הצבעים הבדילה בבירור סוגי תאים שונים ברקמת הלימפה. למידת מכונה המוגדרת על-ידי המשתמש שימשה להפרדת התאים גם כאשר הם דחוסים זה לזה.
