בידוד והכנה של תרחיף חד-תאי של עכברים לניתוח ציטומטריית זרימה

כדי להתחיל, הניחו את העכבר המורדם במצב שכיבה על הספסל הנקי. חותכים לאורך קו האמצע של בטן העכבר ומפרידים את מבני הבטן שכבה אחר שכבה. באמצעות פינצטה, לפתוח בעדינות את omentum גדול יותר ואת הבטן.

לאחר מכן משוך בעדינות את הטחול עם הרצועה gastrosplenic ולהפריד אותו בבוטות מן הרקמות והרצועות שמסביב כדי לקבל טחול שלם. מניחים מסנן תאים 70 מיקרון בכלי תרבית סטרילית 100 מילימטר. מוסיפים את הטחול למסננת התא ומועכים אותו עם בוכנה מזרק.

הוסיפו חמישה עד שמונה מיליליטר של נוזל הדחה הומוגני כדי לדחוף את התאים הטפלניים דרך המסנן לתוך צלחת התרבית. צנטריפוגו את התסנין ב-450 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את הגלולה עם מדלל הדגימה שסופק עם ערכת הפרדת הלימפוציטים.

לאחר ספירת התאים על המוציטומטר, להתאים את ריכוז התא ל 2 X 10 בחזקת שמונה תאים למיליליטר. בצינור צנטריפוגה, קח את אותה כמות של תמיסת הפרדת לימפוציטים כמו תרחיף תא בודד רקמה. בזהירות פיפטה את התרחיף התא היחיד על פני השטח של תמיסת הפרדת הלימפוציטים וצנטריפוגה ב 800 גרם במשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, התבוננו בארבע השכבות בצינור מלמעלה למטה. באמצעות פיפטה, בזהירות למשוך את שכבת לימפוציטים לבן חלבי טבעתי לתוך צינור אחר. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת ניקוי לצינור כדי לערבב את התאים.

צנטריפוגה את מתלה התא ב 250 גרם במשך חמש דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 לספירת תאים.