איסוף מטריצה תת-אנדותלית מתרביות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (REC) למדידת קשיחות במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)

כדי להתחיל, יש לשטוף את החלקות הכיסוי הצולבות של גלוטראלדהיד המצופה בג'לטין ב-PBS המכילות סידן מגנזיום כחמש פעמים על שייקר אורביטלי. במהלך שלוש השטיפות הראשונות, הרימו את החלקות הכיסוי באמצעות פינצטה סטרילית כדי לאפשר שטיפה יסודית של הגלוטראלדהיד. לאחר מכן, החלף את מדיום התרבית של עכבר RECs עם מדיום טרי בתוספת חומצה אסקורבית סטרילית מסוננת.

לאחר 15 יום של טיפול, לשטוף את התאים עם PBS ללא סידן מגנזיום. לדגור על התאים ב 250 מיקרוליטר של חיץ decellularization חם במשך שתיים עד שלוש דקות. לאשר את decellularization של התאים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה.

יש להוציא בעדינות את החיץ מבלי להפריע למטריצה התת-אנדותלית המופרשת REC. לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר של PBS לתוך כל באר. לאחר הסרת PBS, להוסיף 200 מיקרוליטר של DNase חינם RNase אחד.

לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר את כל פסולת התאים. לאחר מכן, הצג את המטריצה התת-אנדותלית הסיבית בקנה מידה מאקרו תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי להציג את סיבי המטריצה הננומטריים העדינים יותר בהגדלה של פי 100.

אגרגטים של מטריצות תת-אנדותל נצפו על פתקי כיסוי הזכוכית לאחר דה-צלולריזציה של תרביות של 10 ימים או 15 יום של RECs אנושיים או עכבריים. מיקרוסקופ קונפוקלי של המטריצות הדה-תאיות הראה מטריצת ננו-פיברילר צפופה, קולגן-IV ופיברונקטין (fibronectin).