הערכה ציטומטרית של זרימה של ביטוי CAR תלוי חמצן בתאי CAR-T

כדי להתחיל, צלחת את תאי T מומרים CAR תרבית לתוך שתי צלחות 12 באר המכילים שני מיליליטר של TGM. הניחו צלחת אחת ישירות באינקובטור לח מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הניחו את הצלחת השנייה בתא אינקובטור חנקן חמצן פחמן דו-חמצני נייד עם רמת חמצן קבועה מראש של 1%איסוף 500, 000 תאים מהלוחות כל 24 שעות בשני התנאים לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינורות ב 500 G במשך חמש דקות. לאחר הסרת supernatant, פיפטה בעדינות מיליליטר אחד של PBS לתוך גלולת התא. השהה מחדש את התאים הכדוריים ב -50 מיקרוליטר של חיץ FACS.

לאחר מכן להוסיף 50 מיקרוליטר של דילול אחד עד 100 של phycoerythrin מצומד נוגדן נגד דגל. פיפטה את המתלים לערבב היטב. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של חיץ FACS לכל צינור.

צנטריפוגה את המתלה המעורב ב 500 G במשך חמש דקות. כעת, הוציאו את הסופרנאטנטים מכל צינור. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 200 מיקרוליטר של מאגר FACS.

העבר את תרחיף התא שנוצר לתוך צינורות ציטומטריה זרימה של חמישה מיליליטר. בצע ציטומטריית זרימה על תרחיף התא כדי לקבוע את ביטוי קולטן האנטיגן הכימרי על פני השטח. הגדר צינורות חדשים כריקים וכ- CAR.

לחץ על FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE וערוץ FITC. לאחר מכן צור ארבע חלקות פיזור כדי לזהות ברצף תאים בודדים, תאים חיים, GFP חיובי ותאים חיוביים PE. הגדר פרמטרים לאיסוף 10, 000 תאים חיים בודדים.

לחץ על השגת נתונים. לאחר שאוסף התאים יציב, לחץ על רשום נתונים. כדי לקבוע את מיקום השערים על פי בקרה שלילית, שער התאים חיוביים עבור EGFP ו phycoerythrin כדי למדוד phycoerythrin חיובי ואת עוצמת פלואורסצנטיות החציונית.

ההיפוקסיה הרגישה לשתי מכוניות ממוקדות הראתה ביטויים גבוהים משמעותית של CAR בתנאים היפוקסיים ביחס לתנאים נורמוקסיים.