הערכה חוץ גופית של ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה

כדי להתחיל, זרעו 1000 תאי מטרה לכל באר של שתי צלחות תרבית רקמה שטוחות 96 המכילות 200 מיקרוליטר של FBSDMEM. למחרת הוציאה בזהירות 100 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מראש כל באר. הוסף קולטן אנטיגן כימרי תאי T או תאי T שאינם מותמרים ב -100 מיקרוליטר של FBSDMEM ביחסים שונים.

הניחו צלחת אחת באטמוספירה של 21% חמצן ואת השנייה בתא אינקובטור חמצן חנקן פחמן דו חמצני נייד תחת אטמוספירה של 1% חמצן. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, השתמשו בפיפטה כדי להעביר בזהירות את כל הסופרנאטנט לצלחת באר U-bottom 96 חדשה. אחסנו את הסופרנאטנט בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לצורך זיהוי ציטוקינים.

כעת הוסיפו 60 מיקרוליטר של חיץ ליזה פסיבי לכל באר ניסיונית של 96 צלחות הבאר השחורות בעלות התחתית השטוחה. הניחו את הצלחות על שייקר למשך 30 דקות כדי להבטיח ליזה תאית יעילה. הוסף 60 מיקרוליטר של מצע לוציפראז גחלילית לכל באר ניסיונית.

השתמש בקורא microplate כדי למדוד את פעילות luciferase באופן מיידי. לבסוף, חשב את אחוז ציטוטוקסיות מנורמל עם המשוואה הנתונה. מכונית המיקוד HER2 הרגישה להיפוקסיה הצליחה להרוג ביעילות תאי מטרה ללא קשר אם האטמוספירה הייתה היפוקסית או נורמוקסית.

לעומת זאת, תאי HER2-BBz-ODD CAR T הציגו ציטוטוקסיות חלשה משמעותית בתנאים נורמוקסיים עבור כל התנאים.