לאחר דגירה של קולונואידים שמקורם במחלת קרוהן במשך שלושה ימים, מטים את הצלחת ומסירים את התווך מקצה הבארות. הוסף 200 מיקרוליטר לבאר של חומר טיפול בציטוקינים המכיל 2.5 מיקרומולר צבע מוות פלואורסצנטי של תאים. לדגור על הקולונואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך זמן הטיפול הנדרש.
לאחר הדגירה, להעביר את הצלחת לשלב של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך דיגיטלי ולאשר כי מצב רעילות מקסימלית קולונואידים הם lysed מלא. באמצעות ערוץ השידור, התמקדו בקולונואיד עם תאים חיוביים ל-SYTOX. לאחר מכן, עבור לערוץ GFP.
כוונן את עוצמת האור ואת זמן החשיפה כדי למקסם את האות הפלואורסצנטי תוך מזעור הרקע. באמצעות הגדרות תמונה ממוטבות, שימו לב לתנאי הרעילות ללא צבע ומרבי כדי להבטיח שהדגימות לא ייחשפו יתר על המידה או לא ייחשפו. קבל תמונות שידור ו- GFP של קולונואידים באמצעות גישת דגימה אקראית על ידי בחירת שדות ראייה העוקבים אחר תבנית רשת קבועה המכסה את כיפת הקולונואידים.
שמור תמונות בפורמט גרפי של רשת ניידת וייצא אותן. גררו ושחררו את קובצי ערכת נתוני התמונות בסרגל הכלים ImageJ ולחצו ברצף על Image, Stacks ו-Images to Stack כדי לשלב את הקבצים. לאחר מכן, לחץ על תמונה ואחריה סוג ו- 8 סיביות כדי להמיר את אוסף התמונות לקובץ של 8 סיביות.
לחצו על הכלי בחירות חופשיות ובחרו ידנית באזור העניין בתמונת השידור. לאחר מכן, עברו בין אוסף התמונות לתמונת ערוץ GFP המתאימה. בסרגל הכלים, לחץ על נתח והגדר מדידות.
בחלון הדו-שיח הגדרת מדידות, סמן את הערך אפור ממוצע והשאר תיבות אחרות לא מסומנות. כשתמונת GFP נבחרה, לחצו על 'נתח ומדוד'. לאחר ניתוח ערכת הנתונים, העתק את כל הנתונים בחלון התוצאות והדבק אותם בגיליון אלקטרוני.
חשב את הממוצע של ערכי האפור הממוצעים של השכפול הטכני עבור כל תנאי. הפחת את הממוצע של המצב הלא מטופל מכל תנאי טיפול. לאחר מכן, חלק כל תנאי טיפול בממוצע הרקע של תנאי הרעילות המרבית.
כדי לחשב את כדאיות התא לאחר הטיפול, החסר את הערכים המנורמלים מאחד. באמצעות המשוואה הנתונה, לחשב את מקדם האינטראקציה perturbagen. תמונות כיסוי פלואורסצנטיות של קולונואידים לאחר שמונה שעות הצביעו על כך שרק האינטרפרון גמא בתוספת קולונואידים שטופלו באלפא TNF היו חיוביים לאות פלואורסצנטי.
לאחר 24 שעות, קולונואידים שטופלו באינטרפרון גמא בתוספת TNF אלפא הציגו אזורים גדולים חיוביים לאות פלואורסצנטי עם פירוט ברור במורפולוגיה של קולונואידים. רמות המוות של תאים לאחר שמונה שעות היו נמוכות עבור קולונואידים בבקרת BSA, עם עלייה קלה במצבים שטופלו באלפא TNF. לאחר 24 שעות, אינטרפרון גמא בתוספת קולונואידים שטופלו באלפא TNF הראו את רמות המוות הגבוהות ביותר של תאים.
ערכי מדד המחירים לצרכן הצביעו על סינרגיזם קל לאחר שמונה שעות וסינרגיזם משמעותי על 24 שעות. זה אישר אינטראקציה סינרגטית תלוית זמן בין אינטרפרון גמא ואלפא TNF.
