לאחר הרחבת קולונואידים שמקורם במחלת קרוהן בצלחת של 48 בארות, יש להסיר בעדינות את התווך מקצה הבאר מבלי לפגוע בכיפת הקולונואידים. הוסף 300 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה אנזימטי בתוספת ROC10 מיקרומולרי ושני מעכבי Y-27632 לכל באר. בעזרת קצה פיפטה P1000, מגרדים את פני השטח של הבאר כדי לשבור את כיפת הקולונואיד ומפיפטים את תרחיף התא מעלה ומטה.
מעבירים את תרחיף התא לצינור 15 מיליליטר. לדגור על קולונואידים שנאספו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. צנטריפוגו את הקולונואידים ב 400 x גרם במשך שלוש דקות ולהסיר את supernatant, משאיר כ 1.2 מיליליטר בצינור.
לאחר מכן הכניסו את קצה פיפטת P1000 למתלה, החזיקו אותה ממש מעל תחתית הצינור והכניסו במהירות את המתלה פנימה והחוצה מהקצה כדי לנתק את הקולונואידים. התבונן בצינור מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שלא נותרו קולונואידים שלמים. ושברי קולונואידים הם בגודל של כ -30 עד 40 מיקרומטר.
לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיית שטיפת אורגנואידים קרה כקרח לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך שלוש דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה במיליליטר אחד של חומר שטיפת אורגנואידים קר כקרח.
העבירו את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ותייגו אותו כצינור מקטע קולונואידים. לאחר הערבוב, העבירו 50 מיקרוליטר מהדגימה לצינור חדש ותייגו אותה כצינורית ספירת תאים. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך שלוש דקות.
הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה אנזימטי, בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632. יש לדגור על צינור ספירת התאים הבודדים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. באמצעות פיפטה P1000 להגדיר 400 מיקרוליטר, פיפטה במהירות את הדגימה.
לאחר מכן התבונן בדגימה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח השעיה של תא יחיד. הוסף מיליליטר אחד של מדיית שטיפה אורגנואידית לצינור ספירת התאים היחיד. לאחר מכן צנטריפוגו את המתלה והסירו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב -50 מיקרוליטר של אמצעי שטיפה אורגנואידים.
מוסיפים 50 מיקרוליטר של טריפאן כחול וסופרים את התאים באמצעות המוציטומטר. בהתבסס על זה, לחשב את ריכוז התאים בצינור קטע קולונואידים. צנטריפוגה את הנפח הנדרש בצינור מיקרו צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן להסיר את supernatant. השהה מחדש את הגלולה בתמצית קרום מרתף, או BME. עכשיו בצלחת מיקרוטיטר 96 באר מודגרת, להפוך פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת BME קולונואיד לכל באר בזהירות לערבב את הפתרון באופן קבוע כדי למנוע זריעה אחידה.
הופכים את הצלחת ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר 20 דקות, כיסו את הכיפות ב-200 מיקרוליטר של מצע התפשטות אורגנואידים שחומם מראש והמשיכו לדגור במשך שלושה ימים.
