כדי להתחיל, שטפו את דגימת האטריום האנושית הטרייה בצלחת זכוכית 100 מ"מ המכילה HBSS סטרילי. נערו בעדינות את הדגימות בצלחת כדי להסיר את שאריות הדם. מעבירים את הדגימה לצלחת 100 מ"מ רטובה בנפח קטן של HBSS.
בעזרת אזמלים מוצלבים, קוצצים את הדגימה לקוביות בגודל שני מילימטר. לאחר מכן, להעביר ארבעה שברי שריר הלב קטנים לצלחת 35 מ"מ. מניחים כיסוי סטרילית על השברים ומפעילים לחץ עדין.
פיפטה 1.5 מיליליטר של DMEM לתוך הצלחת. לאחר מכן דוגרים על צלחות התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תחת תוספת של 5% פחמן דו חמצני. כאשר התרביות הגיעו למפגש של 85%, הסירו את הצלחת מהאינקובטור והשתמשו במלקחיים סטריליים כדי להרים את זכוכית הכיסוי.
לאחר מכן הניחו אותו הפוך על צלחת חדשה בקוטר 35 מ"מ. לאחר מכן הוסיפו PBS סטרילי כדי לשטוף אותו. עכשיו להסיר את שברי שריר הלב.
ואז פיפטה DMEM מהצלחת. השתמש PBS סטרילי כדי לשטוף את הצלחת המכילה את התאים שגדלו. לאחר השלכת השטיפה, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA לכל צלחת, ודגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, למשך חמש דקות.
לאחר הדגירה, להסיר את הלוחות מן האינקובטור ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לאשר את ניתוק התא. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של תמיסת עצירת טריפסין, או TSS, לכל צלחת כדי לחסום את הטריפסיניזציה. מעבירים את תרחיף התא לצינור סטרילי של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה אותו ב 400 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר. לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של DMEM לגלולה ולהשעות אותו מחדש.
מניחים את מתלה התא על צלחת 60 מ"מ. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תחת תוספת של 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, פיפטה שלושה מיליליטר של תמיסת ג'לטין סטרילית 0.2% לכל צלחת 60 מ"מ.
לאחר הדגירה, שואפים את התמיסה ומוסיפים שלושה מיליליטר PBS סטרילי עד לשימוש נוסף. הוציאו את הצלחת המכילה פיברובלסטים לבביים מהאינקובטור. הסר DMEM מהצלחת ושטוף עם PBS סטרילי.
לאחר השלכת השטיפה, יש להוסיף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA לכל צלחת. השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר את ניתוק התא. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של TSS לכל צלחת כדי לחסום את הטריפסיניזציה.
מעבירים את תרחיף התא לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה אותו ב 400 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר.
לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של DMEM לגלולה ולהשעות אותו מחדש. הסר את PBS מהצלחת המצופה בג'לטין 60 מ"מ והכנס את תרחיף התא לצלחת. תרבית את הפיברובלסטים במצב מפגש עד 21 יום.
אחרי 21 ימים של תרבות, שאפו למדיום התרבות. לאחר מכן לשטוף את הצלחות עם שלושה מיליליטר של PBS. לאחר שאיפת PBS והוספת מיליליטר אחד של תמיסת דה-צלולריזציה, התבונן בלוח תחת מיקרוסקופ ניגוד הפוך.
לאחר שתי דקות, יש לקלף בעדינות ארבעה מיליליטר של PBS כדי לדלל את תמיסת הדה-צלולריזציה בצלחות. שאפו את הפתרון המדולל. לאחר מכן שטפו בעדינות את הצלחות עם PBS.
לבסוף, הוסף מיליליטר אחד של PBS לצלחות. אחסנו את הלוחות המצופים במטריצה חוץ-תאית בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הצמיחה של פיברובלסטים משברים קטנים של שריר הלב המקומי שהונחו בתרבית נצפתה בתוך שלושה עד חמישה ימים.
דה-צלולריזציה הביאה לציפוי מטריצה חוץ-תאי על פני הצלחת. ההרכב והארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הלבבית המיוצרת במבחנה נשמרו הודות לדצלולריזציה.
