ברגע שתאי האפיתל הראשוניים של דרכי הנשימה מגיעים למפגש של 80%, מושיבים תאים על מגלשת זכוכית המצופה בקולגן זנב חולדה. לאחר מכן, להוסיף paraformaldehyde כדי לתקן את התאים במשך 12 שעות. שטפו את המגלשה שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת, ודגרו עליה עם 3% אלבומין בסרום בקר ו-0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך שעה.
מוסיפים למגלשה נוגדן ציטוקרטין אנטי-פאן בדילול של אחד עד 500, ודגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את המגלשה שלוש פעמים עם פתרון PBS במשך חמש דקות כל אחד לפני הדגירה עם נוגדן משני בדילול של אחד עד 1, 000 במשך שעתיים בחושך. לאחר שטיפת המגלשה עם PBS, להוסיף DAPI בדילול של אחד עד 1, 000 ולדגור במשך 15 דקות.
שטפו את המגלשה פעם אחת עם PBS במשך חמש דקות. התבונן בשקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להשוות דפוסי ביטוי לבקרה חיובית ובקרה שלילית לאחר ניתוק וצנטריפוגה, השהה מחדש את תאי הפאזה P2 בנפח מתאים של תווך התפשטות. פיפטה מיליליטר אחד של תרחיף התא על התא האפי של קרום הפוליקרבונט Transwell.
הוסף 1.5 מיליליטר של מדיה התפשטות לתא הבסיס של Transwell. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש ביניהם. הכן 50 מיליליטר של מדיום בידול מלא באמצעות הרכיבים הבאים.
מבעבעים סיגריה אחת דרך 12.5 מיליליטר של מדיום בידול, ולאחר מכן מסננים אותה דרך מסנן מזיגה של 0.22 מיקרון כדי להכין תמצית עשן סיגריות או CSE. כדי להבטיח סטנדרטיזציה בין ניסויים ואצוות של CSE, למדוד את הספיגה ב 320 ננומטר על ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, הסר את מדיום ההתפשטות מהחדר האפי והבסיסי של Transwells.
הוסף מדיום התמיינות המכיל ריכוז מתאים של CSE כדי לעורר תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה למשך 28 ימים. במהלך הדגירה, לשטוף את החדר apical פעמיים בשבוע עם PBS ולהחליף את המדיום בחדר הבסיס עם מדיום הבחנה מוכן טרי המכיל CSE. תאי אפיתל של דרכי הנשימה התמינו בהצלחה בממשק נוזלי אוויר תוך 28 ימים.
נוכחותם של תאי ריסון וגביע הודגמה על ידי בדיקת אימונופלואורסנציה של סמן ריסונים, אלפא טובולין אצטילט, וסמן תא גביע מוצין 5AC בהתאמה. כדאיות התא לאחר 24 שעות עם ריכוזי CSE משתנים הראתה כי תאי אפיתל ירדו כאשר הריכוז היה גבוה מ -6% פעילות התא תחת גירוי ארוך טווח לא הראתה מוות תאי משמעותי עם ריכוזים של 2%4% ו- 6% CSE. אבל שינויים בהתנגדות transmembrane תאים exfoliated צוינו.
בנוסף, נצפתה ירידה כוללת בתאים ממוינים ובתאים ריסונים כאשר תרביות תאי אפיתל של דרכי הנשימה נחשפו באופן כרוני ל-CSE.
