כדי להתחיל, צנטריפוגה אחת פעמים 10 בחזקת שבעה קווי תאי HeLa המכילים מקטעי הגבלה טלומריים DNA ב 1, 000g במשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר PBS. לאחר טיפול SDS proteinase K ונתרן כלורי, צנטריפוגה את תרחיף התא ב 16, 900 גרם למשך 10 דקות.
מעבירים את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש ומוסיפים נפח שווה של איזופרופנול, תוך הימנעות משומנים צפים או משקעים. צנטריפוגה במהירות גבוהה, ולשטוף את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של 70% אתנול. לאחר ייבוש כדורית הדנ"א, השהה אותה בזהירות ב-475 מיקרוליטר של חיץ TE וערבב בעדינות על ידי הקשה על תחתית הצינור.
כעת, הוסיפו 25 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר RNA והקישו על הצינור עד שהגלולה מומסת לחלוטין. לאחר מכן, להוסיף 1/10 נפח של שלוש טוחנות נתרן אצטט ושני נפחים של 100% אתנול קר ומניחים את הצינור על מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד שלוש. לאחר שטיפת צנטריפוגה ואתנול 70%, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ TE לגלולת הדנ"א, הקישו על הצינור כדי לערבב, והניחו אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים להמסה מלאה.
עבור עיכול DNA, שלב ארבעה מיקרוגרם של DNA גנומי עם מיקרוליטר אחד של CviAII, שני מיקרוליטרים של חיץ עיכול 10X, ומים כדי להגיע לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. דוגרים על התערובת ב 25 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. במחזור תרמי, מחממים את התערובת ב 75 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, להוריד את הטמפרטורה על ידי 0.1 מעלות צלזיוס כל 30 שניות עד להגיע 25 מעלות צלזיוס. לאחר ניקוי וייבוש, מצפים את החלקות הכיסוי התחתון ב-20 מיקרוליטר של 0.1% ניטרוצלולוז ומוסיפים חרוזי ייחוס. אופים את החלקות הכיסוי בחום של 100 מעלות במשך ארבע דקות.
הרכיבו את כריך תא הזרימה. ולאחר חימום ב 85 מעלות צלזיוס, להשתמש בשני מטושים כדי לעסות את ההרכבה עד Parafilm אוטם את התעלה. לשטוף 10 מיקרוליטר של חרוזי M-270 חמש פעמים עם 50 מיקרוליטר של חיץ עבודה באמצעות מגנט.
לאחר השטיפה, מוסיפים את החרוזים על גבי הדנ"א הגנומי המעוכל לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. העבירו בעדינות את הצינורית כמה פעמים כדי לערבב את החרוזים ואת דגימת הדנ"א. השאירו את התערובת על קרח למשך שעה.
לאחר הדגירה, שטפו את התערובת עם 500 מיקרוליטר של חיץ עבודה שלוש פעמים באמצעות מגנט כדי למשוך את החרוזים למטה עם מרווחים של 10 דקות בין כביסה. השהה מחדש את הדגימה במאגר עבודה, וטען 30 מיקרוליטר של התערובת לתוך תא הזרימה. שטפו את החרוזים המגנטיים הלא קשורים לאחר 30 דקות.
לאחר הנחת תא הזרימה על גבי עדשת המטרה, בחרו זוג מגנטים מעוקבים בקוטר חמישה מילימטר המסודרים בתצורה אנכית, ויישרו את מחזיק המגנט עם ציר ה-x של נתיב האור של הפינצטה המגנטית לצורך הדמיה. הפעל את תוכנת התכנות הגרפית וחבר את הבקרים לפינצטה המגנטית. התאימו את שדה הראייה למיקום חרוז ייחוס בתחתית תא הזרימה, וכווננו מעט את עדשת המטרה כך שחרוז הייחוס יציג טבעות שבירה ברורות.
כתוב סקריפט ב- MATLAB כדי לשלוט בתנועות מוטוריות עבור מבחני כבש כוח. ייבא את הסקריפט לתוכנת תכנות גרפית כדי לבדוק את ניסויי המולקולה היחידה. בקצב זרימה איטי, טען 200 מיקרוליטר של TRF1 10-nanomolar לתוך תא הזרימה.
לאחר 30 דקות של כריכה, בחר סקריפט לניסוי כבש כוח עם קצב העמסת כוח של פלוס/מינוס פיקוניטון אחד לשנייה. תן שם לקבצי הנתונים והפעל את הניסוי. שלמות הדנ"א הגנומי אושרה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, כאשר TRS שהתקבל הציג אורכים עקביים על פני קווי תאים אנושיים שונים.
רצפים חוזרים טלומריים ב-TRS זוהו באמצעות כתמים דרומיים, והראו אותות הכלאה ברורים. עקומות הארכת הכוח מבדיקת כבש הכוח הראו דפוסי זיגזג במהלך מתיחה, מה שמצביע על שבירת אינטראקציות DNA חלבוניות. קינטיקה הדיסוציאציה של קומפלקסים חלבוני DNA טלומריים הראתה קשר ליניארי בין כוח לקצב דיסוציאציה.
יתר על כן, הטרוגניות האורך של דנ"א טלומרי מתאים אנושיים חוקרת את מנגנון היווצרות הלולאה בטלומרים באורכים שונים.
