כדי להתחיל, מקם את הריאגנטים הדרושים להכנת אלקטרופורזה ג'ל על פלטפורמת עבודה. הוסיפו Tris/Borate/EDTA, או TBE, לאגרוז וחממו את התמיסה במיקרוגל. לאחר מכן, יוצקים את 0.4-0.5% agarose לתוך מגש יציקה להכין ג'ל agarose ממד הראשון ולתת לו להתמצק במשך שעה אחת.
לאחר המיצוק יש להעמיס את הסולם בתוך 3 הסנטימטרים הראשונים ביחס לקצה השמאלי ביותר של הג'ל. לאחר מכן טען את דגימות ה- DNA המתעכלות עם אנזימי הגבלה, ומבטיח מרחק של 3 סנטימטרים בין כל זוג. הפעל את הג'ל ב- TBE למשך 19-24 שעות במתח של 0.85 וולט לסנטימטר כדי להפריד את חומרי הביניים לפי גודל.
למחרת, הסר את הג'ל מהחיץ. הבלו את 3 הס"מ הראשונים של הג'ל המכיל את הסולם. מכתימים את מקטע הג'ל ב-TBE המכיל 0.3 מיקרוגרם למיליליטר אתידיום ברומיד למשך 10-15 דקות.
לאחר מכן דמיינו את הסולם באמצעות מערכת תיעוד ג'ל. על ג'ל האגרוז, מוסיפים 1.3 ס"מ למיקום המשוער, ומניבים ערך של A.לאחר מכן מפחיתים 7.5 ס"מ מערך A, ומניבים ערך B.מיישרים את הסרגל כנגד ג'ל הממד הראשון וחותכים אופקית לרוחב בערכים A ו-B.לאחר מכן חותכים אנכית את שטח 3 הסנטימטרים השמור לכל דגימה. במגש יציקה חדש, סובב את המקטעים בכיוון השעון ומקם אותם במיקום של בארות הדגימה.
הכינו את ג'ל האגרוז מהממד השני בריכוז של 1-1.3% ב-TBE עם 0.3 מיקרוגרם למיליליטר אתידיום ברומיד. מחממים את הג'ל, ועם התקררות לכ-55 מעלות צלזיוס, יוצקים אותו על פלחי הממד הראשון המסובבים. הניחו לג'ל להתמצק למשך שעה.
לאחר התמצקות, להעביר את הג'ל לתא המכיל TBE ב 0.3 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד, ולאפשר לו לאזן במשך 30 דקות. מכסים את הג'ל ופועלים 9-10 שעות במתח של 4.23 וולט לסנטימטר ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את ג'ל הממד השני מהחדר ושחרר את מקטעי ה- DNA למשך 10 דקות בתמיסת חומצה הידרוכלורית מולרית 0.24 עם נדנוד עדין.
שטפו את הג'ל במים נטולי יונים, והשרו אותו בנתרן הידרוקסידי מולארי 0.4 למשך 10-15 דקות. לאחר מכן קפלו שני גיליונות ארוכים של נייר כרומטוגרפיה בניצב לרוחב יריעת הזכוכית, המשתרעים לתוך המיכל. כדי להרכיב את הכתם הדרומי, למלא מיכל עם 1 ליטר של 0.4 hydroxide נתרן טוחן.
יישרו יריעת זכוכית ארוכה לרוחב המיכל. יש להרטיב את החלק העליון של הנייר עם נתרן הידרוקסידי ולהסיר בזהירות את כל בועות האוויר מתחת לפני השטח שלו. משרים שלושה גיליונות נייר כרומטוגרפיה עם נתרן הידרוקסידי ומניחים אותם על נייר התיקייה.
הסירו את בועות האוויר. הפכו את ג'ל הממד השני והניחו אותו על ניירות הכרומטוגרפיה. הרטיבו קרום ניילון טעון חיובי במים שעברו דה-יוניזציה והניחו אותו מעל הג'ל.
לאחר מכן מניחים שלוש יריעות כרומטוגרפיה רטובות במים נטולי יונים, מעל הממברנה. כסו כל נתרן הידרוקסידי חשוף במיכל בניילון נצמד למניעת אידוי. הניחו ערימה בגובה 0.3-0.5 מטר של מפיות או מגבות נייר מעל הכתם.
דחסו את הכתם כולו עם משקולת כדי להקל על פעולה נימית הדוקה, והשאירו אותו למשך יומיים להעברת DNA לממברנה.
