שמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים או PSCs בצלחות תרבית של שש בארות ואשר את צפיפות התאים תחת מיקרוסקופ. עבור קרדיומיוציטים או התמיינות CM, זרעו PSCs לתוך צלחת תרבית 96 בארות במדיום הכנה PSC. בשלב הראשון של התמיינות הלב, כאשר PSCs מגיעים למפגש של 80% עד 90%, העבר את מדיום התמיינות בינוני ל- CM עם שניים עד 20 CHIR מיקרומולארי.
לאחר 24 עד 48 שעות של טיפול ב-CHR, יש לשנות את המדיום למדיום דיפרנציאציה רענן של CM. בשלב השני או השלישי, החלף את המדיום במדיום התמיינות CM בתוספת חמישה IWR1 מיקרומולרי בתרבית עד היום החמישי. לאחר מכן שנה את המדיום למדיום התמיינות CM ושמור אותו עד ימים שש עד שבע, כאשר PSCs להתמיין לתאי אב לבביים, או CPC.
ביום 10 או ביום 12, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בזמן הצביעה, לטפל בתאים עם פתרון permebilizing במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. יש לדגור על הדגימה עם נוגדן CTNT ראשוני למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן יש לטפל בדגימה עם נוגדנים משניים ב-PBS המכילים אלבומין בסרום בקר 1% למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הנוגדן המשני מהתאים, מכתימים את הגרעינים על ידי Hoechst למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים באמצעות PBS לפני הוספת 100 מיקרוליטר PBS לכל באר כדי למנוע ייבוש.
כדי לאסוף תמונות אימונופלואורסצנטיות של ברייטפילד ו-CTNT של שלבים שונים של התמיינות באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי התומך בתרבית תאים חיים, פתח את התוכנה וצור תכנון ניסויי חדש. בחר מטרה 5X ומיזוגים 2X2 להדמיה. בתפריט הערוצים, הוסף ערוץ TL brightfield עבור brightfield ו- AF 488 ו- H 33 42 ערוצים להדמיית immunofluorescence.
שנו את נתיב האור במערך ההדמיה. בתפריט אוסף Z, קבעו את מספר הפרוסות והמרווחים בשעת הסריקה. בחלון הניווט והאריחים, הגדר את אזורי האריחים לפי ספק והגדר 25 אריחים חמש עמודות לחמש שורות עבור באר אחת.
לקבלת תמונות, תחילה הכניסו את צלחת תרבית התאים למגש הדגימה וטענו את המגש בתוך המיקרוסקופ. אם הדגימה מורכבת מתאים חיים, פתחו את מערכת החימום ואת משאבת הפחמן הדו-חמצני כדי לשמור על התנאים המתאימים לתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. פתח את פרוייקט הניסוי המוגדר מראש.
פתח את תפריט האריחים וכייל את מיקום הלוח באופן ידני. בחלון הניווט והאריחים, בחר את הבארות הדרושות ולחץ על צור כדי לבנות אזורי אריחים עבור בארות אלה. לחץ על אימות אזורי האריח בתפריט האריחים והפעל מוקד אוטומטי כדי לאמת את כל הבארות.
לאחר מכן תקן ידנית את המיקוד של כל באר. לחץ על לחצן התחל ניסוי והמתן לדימות אוטומטי. בדרך כלל, לוקח בערך 1.2 שעות לסרוק צלחת תרבית שלמה של 96 בארות.
במסגרת העיבוד, בחר ייצוא תמונה, בחר את סוג הקובץ של תבנית TIFF לא דחוסה או תבנית PNG והחל.
