כדי להתחיל, אספו את שתילי Columbia-0 Arabidopsis הקפואים בני חמישה ימים למיכל החנקן הנוזלי. טוחנים את השתילים באמצעות הומוגנייזר לאבקה למשך דקה. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מיצוי פוליזום לצינור.
הפוך ומערבל את הצינור כדי לערבב את הדגימה. צנטריפוגה תמיסת מיצוי ב 12, 000G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סנן את הסופרנאטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי לקבל תמיסת מיצוי ברורה ונטולת חלקיקים.
מעמיסים את הסופרנאטנט המסונן על שיפוע הסוכרוז שהוכן מראש וממתינים עד שהוא מגיע לשיווי משקל. לאחר מכן, אולטרה-צנטריפוגה את השיפוע באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 210, 000G למשך 3.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם קצבי תאוצה והאטה מרביים. הרנ"א הלא פוליזומלי והפוליזומלי מופרדים על בסיס צפיפותם בתמיסת הסוכרוז ההדרגתית המתאימה.
הכינו את תמיסת המרדף עבור משאבת מזרק מיקרו-נפח המורכבת מ-70% סוכרוז, 10% גליצרול ו-0.02% ברומופנול כחול. מערבבים היטב את התמיסה במשך 30 עד 40 דקות. לאחר הזרקת פתרון המרדף לתוך השיפוע, באמצעות התוכנה, לשלוט על מקטע שיפוע צפיפות.
לאחר מכן כיילו את המכונה עם מים נטולי יונים. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, הניחו את הצינור על מקטע שיפוע הצפיפות. באמצעות מערכת פירסינג הצינור, חבר את הצינור למשאבת המזרק ולגלאי האולטרה סגול.
העבר את מקטע שיפוע הצפיפות למצב בקרת תוכנה מרחוק. הגדר את קצב זרימת ההזרקה של משאבת מזרק מיקרו נפח לשלושה מיליליטר לדקה. התחל את התהליך לקבלת גרף פרופיל פוליזום על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב 254 ננומטר באמצעות המפריד.
בהתבסס על מדידות פרופיל פוליזום, לאסוף את שברי RNA שאינם polysomal ו polysomal בנפרד. ערבבו היטב את שברי הרנ"א שנאספו עם תמיסת טרום קור פעמיים עתירת מלח. לאחר מכן להוסיף שמונה מיקרוליטר של מלאי מדולל של פולי-A אאוקריוטי בקרת RNA מהערכה.
צנטריפוגה תמיסת מלח גבוהה מעורבב RNA עם רוטור דלי מתנדנד ב 450, 000G במשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. בזהירות לשפוך את supernatant ולשטוף את גלולת RNA שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מים טרום קר DEPC מטופל. לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף 500 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA לדגימת RNA.
מערבבים ודוגרים במשך 10 דקות. מוסיפים 100 מיקרוליטר כלורופורם ומערבבים היטב. יש לדגור במשך 10 דקות כדי לאפשר הפרדת פאזות.
צנטריפוגה את התערובת ב 12, 000G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את השכבה המימית השקופה העליונה המכילה RNA לצינור חדש ומערבבים אותה בעדינות עם נפח שווה של איזופרופנול. דוגרים על התערובת במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לזרז את הרנ"א.
לאחר המשקעים, צנטריפוגות שוב ומשליכות את הסופרנטנט, ומשאירות את גלולת הרנ"א בתחתית. לשטוף את גלולת RNA עם מיליליטר אחד של טרום קר 75% אתנול. צנטריפוגה ב 12, 000G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולייבש באוויר את גלולת RNA.
לאחר הייבוש, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר מים שטופלו ב-DEPC. למדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר ספקטרום מלא ב 220 עד 750 ננומטר, תוך התמקדות בצפיפות אופטית ב 260. פרופיל הפוליזום הראה הפרדה ברורה בין השברים הלא-פוליזומליים והפוליזומליים בתנאים רגילים.
לחץ חום ב 40 מעלות צלזיוס הפחית באופן משמעותי את עוצמת האות של החלק הפוליזומלי, והשפעה זו התהפכה לאחר התאוששות של שעתיים ב -22 מעלות צלזיוס, מה שהחזיר את האות לרמות שליטה. תוצאות מיצוי RNA הצביעו על כך שלחץ חום הפחית את אחוז הרנ"א במקטע הרב-סוכרי, ששוחזר לאחר ההחלמה ב-22 מעלות צלזיוס.
