העבודה במעבדה שלנו נתמך על ידי אות הקריירה MCB0551798 מן הקרן הלאומית למדע אזור להעניק R15GM86839 מן NIGMS-NIH.

1. צמיחה הקרנת UV. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200μl של תרבות לילה טרי פלסמיד המכיל את pBR322 גדל דייויס בינוני 1 בתוספת גלוקוז 0.4%, 0.2% חומצות casamino, ו -10 מיקרוגרם / מ&quot;ל תימין (בינוני DGCthy) ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין הוא pelleted. התא הוא גלולה resuspended אז בינוני DGCthy 200μl חסר אמפיצילין ומשומשים לחסן 20 מ&quot;ל של מדיום DGCthy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות גדלים ללא בחירה אמפיצילין ב חממה רועד ב 37 ° C עד 600 OD של 0.5 (~ 5 x 10 8 תאים / מ&quot;ל). צמיחה ללא אמפיצילין נמנע מבחר ביניים נגד שכפול חריגה או יצרניים שעלולות להתעורר בתוך כמה מוטציות. בנוסף, אם באמצעות אור UV כדי לגרום נזק, הסרת אמפיצילין מהתקשורת הוא הכרחי משום שהוא סופג בתוקף על אורכי גל אלה מגינים על התאים, להפחית את המינון האפקטיבי של UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אורות צהובים, התרבות ממוקם צלחת בקוטר 15 ס&quot;מ פטרי על פלטפורמה מסתובבת על תסיסה. התרבויות שלנו ממוקמות במרחק מנורה 15 וואט קוטל חידקים שמייצר שיעור החשיפה של ~ 1 J/m2/sec, הנמדד באמצעות פוטומטר UVC. תרבויות הם מוקרן עם 50 J/m2 ואז להציב מיד בחזרה לתוך רעד 37 ° C החממה למשך הניסוי. מינון זה מייצר, בממוצע, 1 cyclobutane פירימידין dimer כל 4.5 קילו של ssDNA. תאורה צהובה מונע photoreactivation-היפוך של הדימרים פירימידין cyclobutane ידי photolyase. </li></ol> 2. בידוד ה-DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפעמים כאשר ביניים שכפול הם להיבדק, aliquot 0.75 מ&quot;ל של התרבות מכניסים 0.75 הצפת מ&quot;ל קרח קר NET30 (100 mM NaCl, 10 mM טריס, pH 8.0, 30 mM EDTA) והניח על הקרח עד סוף את הקורס הזמן. אנחנו בדרך כלל להפעיל כמובן זמן 90 דקות, עם דגימות שנבדקו על 0, 15, 30, 45, 60, ו - 90 דקות. EDTA וטמפרטורה קרה לשרת ביעילות להפסיק שכפול ותיקון כריתה נוקלאוטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם כל כך pelleted, resuspended ב μl 150 ליזוזים של 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNaseA ב TE (10 mM טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA), ו lysed על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בשלב זה, 10μl של proteinase K (10mg/ml) ו 10μl sarkosyl של 20% נוספים ואת הדגירה הוא הורשה להמשיך עבור שעות 1. Proteinase K ו sarkosyl לעזור לשחרר את שברי דנ&quot;א עשויה להיות קשורה הממברנה או חלבונים לפני מיצוי פנול מתרחשת. מאז שכפול ה-DNA באופן פעיל כרוכה לעתים קרובות קומפלקסים חלבונים או קרום, זה עוזר להגדיל את התשואה של שברי שכפול, כי הם החלימו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות המחולצים אז על ידי הוספת 2 כרכים של פנול לטעום כל הצינורות הם הפוכים בעדינות במשך 5 דקות. ואז 2 כרכים של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24 / 1) מתווספות ואת צינורות הם הפוכים בעדינות שוב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות centrifuged ב 14,000 סל&quot;ד ב microcentrifuge במשך 5 דקות ואת השלב מימית העליון של המדגם כל מוסר, והניח לתוך צינור טריים. אז 4 כרכים של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24 / 1) מתווספות, הצינורות הם הפוכים בעדינות במשך 5 דקות, centrifuged שוב 14,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב העליון, מימית במדגם כל dialyzed מכן על ידי תצפית 100μl המדגם על כל דיסק 47mm 0.025 מיקרומטר Whatman הנקבוביות אשר צף על 250 מ&quot;ל של 0.1X TE בכוס במשך שעה 1. בגלל מבנים שכפול עם אזורים גדיל בודד או נקודות סניף רגישים יותר גז, אנחנו בדרך כלל לגזור את קצות פיפטה שלנו עם סכין גילוח לעשות פה יותר ולמזער את כוחות הגזירה. באופן כללי, pipetting צריך להישמר עד למינימום עד אחרי ה-DNA כבר מעוכל עם אנזימי הגבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם כל מעוכל לאחר מכן עם PvuII (ניו אינגלנד Biolabs) אשר linearizes הפלסמיד רק במורד הזרם מן המקור של שכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העמסה של ג&#39;ל agarose, 100μl כלורופורם 20μl של צבע טעינת 6X המכיל Cyanol כחול קסילן Bromophenol מתווספים מדגם כל מעורבות. ואז, 40μl השלב מימית המכילה את צבען טוען הוא נטען לתוך הג&#39;ל. כדי למזער הטיות מבניות, חפצים מבניות, הגז DNA, הליך זה הבידוד אינו כולל את השלבים הבאים כדי להעשיר עבור אזורים גדיל בודד, נמהרת, או לרכז את דגימות DNA לאחר תמוגה התא. </li></ol> 3. 2D ג&#39;ל וניתוח הדרום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח הוא שונה מ 3. עבור ממד -1, דגימות ה-DNA מוגבל מופעלים באמצעות 0.4% agarose ג&#39;ל 1X TBE ב 1V/cm. ליטר אחד של פתרון TBE 10X מניות מכילה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 108 גרם טריס Base </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 55 גרם חומצת בור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 מ&quot;ל 0.5m EDTA (pH 8.0) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן הינד למבדה III גודל נטען במסלול הראשון, ואז דגימות נטענים בכל שביל אחר. אנחנו בדרך כלל בטווח ד firstimension ~ 12-15 שעות. דילוג על נתיבי מקלה על הפרוסה נתיבים החוצה להטיל בממד השני. מתח נמוך נמוך אחוז agarose ג&#39;ל משמש כדי להפריד בין קטעי דנ&quot;א מבוססת בעיקר על גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הממד השני, נתיבי ג&#39;ל הם פרוסים מתוך ג&#39;ל הממד הראשון באמצעות סכין קצבים גדול. במסלול הראשון המכיל את סמן למבדה הינד III יכול להיות מוכתם ברומיד ethidium. באמצעות סמן למבדה הינד III כמו יבול מדריך, וזורקים את האזור של ג&#39;ל כי הוא מתחת היכן הפלסמיד לינארית צפוי לרוץ. בתנאים אלה, אנו מוצאים כי pBR322 לינארית רץ מעט מעל cyanol קסילן הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיל את הממד השני, נתיב אחד ממוקם בצורה אופקית לרוחב החלק העליון של גלגלית ג&#39;ל ריקה. הפתרון של agarose 1.0% ב 1X TBE מוכן ומקורר עד 55 ° C. בשלב זה, הפתרון הוא ג&#39;ל זרמו להטיל את המימד השני, מוודא כדי לכסות לחלוטין את פרוסות ג&#39;ל. לאחר ג&#39;ל הציבה, היא לרוץ 6.5V/cm ביחידה אלקטרופורזה המאפשר למאגר כדי recirculate. אנחנו בדרך כלל להפעיל את המימד השני ~ 5.5-7 שעות. מתח גבוה גבוה אחוז agarose ג&#39;ל ביעילות המפריד בין שברי DNA המבוססת על הצורה שלהם, כמו גם גודל. צורות קוי לרוץ יותר לאט דרך הממד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, הג&#39;ל היא שטפה אז H 2 O, שטף פעמיים 400ml של חומצה הידרוכלורית 0.25M במשך 15 דקות, לשטוף עם H 2 O;, ורחץ אז פעמיים 400 מ&quot;ל 0.4M NaOH במשך 30 דקות. חומצה שוטף לשרת באופן חלקי ניק מולקולות DNA לרסיסים קטנים יותר להעביר בצורה יעילה יותר. צעד זה הוא הכרחי בשל גודל גדול של צורות יוצא דופן ביניים שכפול הדנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ&quot;א של הג&#39;לים הוא הועבר לאחר מכן N Hybond + קרום ניילון 4. אנו משתמשים במערכת מטה העברת אלקלי עם NaOH 0.4M. בקצרה, שני גיליונות נייר סופג ספוג 0.4M NaOH ממוקמות על ערימה גדולה של מגבות נייר. הממברנה ניילון ספוגה גם 0.4M NaOH והניח על גבי נייר סופג. הג&#39;ל הוא אז שכבתית בזהירות על גבי זה, ואחריו עוד חתיכה של נייר סופג, הרטובות בפתרון NaOH. לבסוף, חתיכה ארוכה של נייר סופג הרטובות היא שכבתית לרוחב החלק העליון ואת שני הקצוות שלה ממוקמים לתוך מנות המכיל 1 ליטר של תמיסת NaOH 0.4M לשמש הפתיל. אנחנו בדרך כלל לאפשר את העברת ה-DNA של 6-12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום ניילון מוסר, שטף 20-30 שניות בתוך מאגר SSC 5X, והניח בתוך בקבוק הכלאה רולר המכיל פתרון Prehybridization 10.5ml. ואז, הממברנה היא מודגרות ב 42 ° C עם רוטציה יותר 6hrs. Prehybridization פתרון: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.0 מ&quot;ל לפוראמיד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 20% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 מ&quot;ל 20X SSC * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.0 מ&quot;ל של 50X Denhardt * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 0.5 מ&quot;ל סלמון DNA (10mg/ml) * מתכונים SSC ו Denhardt זה ניתן למצוא 5 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התקופה prehybridization, 1 מיקרוגרם של pBR322 פלסמיד התווית 32P בתרגום הכינוי לפי הפרוטוקול מסופק על ידי אלפא רוש באמצעות שכותרתו [32-P], dCTP. החללית radiolabeled (100μl) הוא מפוגל ידי דוגרים על 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך צינור כובע בורג microcentrifuge, ולאחר מכן הניח מיד על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החללית מפוגל מתווסף פתרון 5.9 מ&quot;ל הכלאה, אשר מכיל: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.0 מ&quot;ל לפוראמיד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל SSC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.0 מ&quot;ל H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.15 מ&quot;ל של 50X Denhardt </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.10 מ&quot;ל 20% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.15 מ&quot;ל זרע 10mg/ml סלמון DNA </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון prehybridization נמזג מהבקבוק הרים את הפתרון הכלאה הוא שפך פנימה בקבוק רולר הוא חזר אז על 42 מעלות צלזיוס חממה וסובב יותר 12hrs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הכלאה נמזג מהבקבוק הרים. ואז, כתם הוא שטף 4 פעמים למשך 20 דקות בבקבוק 150 מ&quot;ל עם רולר ~ של פתרון לשטוף המכיל SSC 0.5X, SDS 0.1% ב 42 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף האחרון, קרום מושם על מגבת נייר עד הנוזל נעלם לעין. הממברנה הוא עטוף מכן לעטוף פוליוויניל כלוריד, פלסטיק חשוף למסך phosphorimager. אנו לחזות ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות סטורם 840 ותוכנה ImageQuant הקשורים אליו. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ביניים שכפול פלסמיד נצפתה נוכחות והיעדר נזק UV-Induced DNA. הדפוס ההגירה של PvuII מתעכל pBR322 פלסמיד ציין ידי ניתוח 2D-agarose ג&#39;ל הוא ניתח. Non-שכפול פלסמידים ליניארי לרוץ כמו שבר 4.4 קילו ליניארי. פלסמידים שכפול טופס בצורת האות V מבנים להעביר איטי יותר מאשר אי - שכפול שברי בשל גודל גדול שלהם לאnlinear צורה. דפוס ההגירה צורות קשת המשתרע מן האזור ליניארי לעבר הבאר. בעקבות UV-קרינה, פעמיים Y או X בצורת מולקולות הם נצפו באזור חרוט כי נודד לאט יותר מאשר קשת של Y בצורת מולקולות. דוגמה של ניתוח הדרומי של הג&#39;ל 2D נחקר עם 32P שכותרתו pBR322 מוצג עבור תאים מיד לאחר הקרנת UV ו 15 דקות לאחר הקרנת UV (לשכפל באישור המו&quot;ל).

<ol>
	<li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin.">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli.">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li><li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li><li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences.">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning - A laboratory manual. , (2001).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli.">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li><li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork:+a+comparison+to+UV-induced+arrest.">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecBCD+and+RecJ/RecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li><li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions.">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תוצאות אופייניות שהתקבלו תאים סוג בר בנוכחות והיעדר נזק UV-Induced מוצגים באיור 1. בהעדר נזק, ~ 1% מה-DNA של פלסמיד הכולל ניתן למצוא קשת Y כאשר התאים גדל במהירות בשלב מעריכי. בעקבות הקרנה, גידול חולפות מולקולות בצורת Y הוא ציין כמו מזלגות שכפול חסום לצבור באתרים שניזוקו. ה-X בצור...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>An example of the Southern analysis of the 2D gel probed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>G15T8</td>
<td>Yellow Lighting</td>
</tr>
<tr>
<td>15 &mu;watt germicidal lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylvania</td>
<td>F20T12/GO</td>
<td>UV Lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Daigger</td>
<td>EF28195T</td>
<td>UVC photometer</td>
</tr>
<tr>
<td>0.025 &mu;m pore disks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>VSWP04700</td>
<td>Floating dialysis disks</td>
</tr>
<tr>
<td>PvuII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>ER0632</td>
<td>Restriction Endonuclease</td>
</tr>
<tr>
<td>Nick-translation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>976776</td>
<td>To make 32P-labeled probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-704</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>
<tr>
<td>Nylon membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN203S</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis

שכפול מדויק בנוכחות נזק לדנ&quot;א אחראי על רוב rearrangements הסלולר mutagenesis נצפתה בכל סוגי התאים הוא האמין נרחב כדי להיות מקושר ישירות עם התפתחות של סרטן בבני אדם. נזק לדנ&quot;א, כגון זה הנגרם על ידי קרינת UV, קשות ביכולתם של שכפול לשכפל את הגנום תבנית מדויקת. מספר מוצרים הגן זוהו נדרשים כאשר שכפול ה-DNA מפגשים נגעים בתבנית. עם זאת, האתגר שנותר היה לקבוע כיצד החלבונים האלה נגעים במהלך תהליך השכפול<em&gt; In vivo</em&gt;. שימוש coli Escherichia כמודל למערכת, אנו מתארים תהליך בו שני ממדי agarose ג&#39;ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את התשומות מבניים שעולות על פלסמידים שכפול<em&gt; In vivo</em&gt; הבאים UV-Induced נזק לדנ&quot;א. הליך זה נעשה שימוש על מנת להוכיח כי מזלגות שכפול נחסם על ידי נזק UV-Induced עבר מהפך זמני, כי הוא התייצב על ידי RecA ומוצרי מספר גנים הקשורים מסלול RecF. הטכניקה מוכיח כי אלה ביניים שכפול נשמרות עד זמן זה בקורלציה עם הסרת נגעים על ידי תיקון כריתה נוקלאוטיד וקורות חיים שכפול.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis at JoVE.com

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

10.6K Views.  Portland State University. אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

Video: Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living cells. The proposed instrument extends the sensitivity of label-free optical microscopy to nanoscale changes in organelle size and shape and can be used to accelerate the study of the structure-function relationship pertaining to organelle dynamics underlying fundamental biological processes, such as programmed cell death or cellular differentiation. The microscope can be easily implemented on existing microscopy platforms, and can therefore be disseminated to individual laboratories, where scientists can implement and use the proposed methods with unrestricted access.
The proposed technique is able to characterize subcellular structure by observing the cell through two-dimensional optical Gabor filters. These filters can be tuned to sense with nanoscale (10's of nm) sensitivity, specific morphological attributes pertaining to the size and orientation of non-spherical subcellular organelles. While based on contrast generated by elastic scattering, the technique does not rely on a detailed inverse scattering model or on Mie theory to extract morphometric measurements. This technique is therefore applicable to non-spherical organelles for which a precise theoretical scatter description is not easily given, and provides distinctive morphometric parameters that can be obtained within unstained living cells to assess their function. The technique is advantageous compared with digital image processing in that it operates directly on the object's field transform rather than the discretized object's intensity. It does not rely on high image sampling rates and can therefore be used to rapidly screen morphological activity within hundreds of cells at a time, thus greatly facilitating the study of organelle structure beyond individual organelle segmentation and reconstruction by fluorescence confocal microscopy of highly magnified digital images of limited fields of view.
In this demonstration we show data from a marine diatom to illustrate the methodology. We also show preliminary data collected from living cells to give an idea of how the method may be applied in a relevant biological context.

We demonstrate a dark-field microscopy method based on Gabor-like filtering to measure subcellular dynamics within single living cells. The technique is sensitive to alterations in the structure of organelles, such as mitochondrial fragmentation.

פיזור מיקרוסקופיה אופטית על בסיס דו מימדי מסננים גאבור

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.