סמיר חמדאן סייעו בפיתוח טכניקה זו. E. חלבונים הם coli מהמעבדה של פרופ &#39;ניק דיקסון, חלבונים אוניברסיטת Wollongong, ו T7 הם מן פרופ&#39; צ&#39;רלס ריצ&#39;רדסון, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד. העבודה נתמכת על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (GM077248 כדי AMvO) ואת קופין ג&#39;יין צ&#39;יילדס קרן (JJL).

לפני ביצוע ניסוי יחיד מולקולה שכפול, כמה חומרים צריכים להיות מוכנים מראש. 1. שכפול ה-DNA תבנית המצע עבור התגובה שכפול הוא biotinylated, מעגל זנב M13 מתגלגל מוכן באמצעות תקן 1,2 טכניקות לביולוגיה מולקולרית. חומרים: M13mp18 גדילי דנ&quot;א יחיד, תחל Biotinylated oligonucleotide הזנב (5&#39;-ביוטין-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &quot;), T7-DNA פולימראז, גוש חום, פנול / Isoamyl אלכוהול / כלורופורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשל אוליגו זנב biotinylated ל M13 על ידי הוספת יתר של פי 10 של אוליגו ב TBS חיץ (330 nM זנב אוליגו, 33 nM M13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את התערובת ל 65 ° C בבלוק חום. מחומם פעם, להפוך את חום לחסום את ולאפשר קירור איטי שצריך לחשל תחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את M13 דרוך אל תערובת של 64 nM DNA פולימראז T7 ו חיץ T7 שכפול המכיל dNTPs ו MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות להרוות עם 100 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מלא ב-DNA מוצר עם מיצוי פנול / כלורופורם / isoamyl אלכוהול dialyze למאגר TE או אחסון אחר חיץ מתאים לקבוע ריכוז ה-DNA (Back-תמצית כל שלב אורגני לשחזר שום שיורית דרוך M13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איטרציה אחת של הכנת תבנית יכול בקלות להפוך כמה מיליליטרים של תבנית ריכוז nanomolar, מספיק מאות עד אלפי ניסויים-מולקולה בודדת. </li></ol> 2. פונקציונליות Coverslips לחיבור ה-DNA כדי coverslip הזכוכית, הזכוכית היא פונקציונליות הראשון עם aminosilane, אשר יחד ואז מולקולות PEG biotinylated. ציפוי זה עוזר להפחית את האינטראקציות ספציפי של דנ&quot;א וחלבונים שכפול עם המשטח 1,3. חומרים: coverslips זכוכית, צנצנות מכתים, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k-NHS אסתר, ביוטין, PEG5k-NHSester, אצטון, 1M KOH, אתנול תנור, sonicator Bath <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקיון יסודי של coverslips זכוכית על ידי הצבת אותם מכתים צנצנות ממלאים את הצנצנות עם אתנול. Sonicate במשך 30 דקות ולשטוף את הצנצנות מתמלאות 1 M KOH. Sonicate במשך 30 דקות הן חזרו שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התגובה functionalization הראשון, כל עקבות מים צורך להסיר. ממלאים את הצנצנות עם אצטון sonicate במשך 10 דקות. שוטפים את הצנצנות שוב עם אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2% v / v פתרון של מגיב silane ב אצטון. הוסף את הצנצנות מכתים ו להתסיס במשך 2 דקות. תגובה זו זוגות הקבוצה alkoxy של aminosilane כדי זכוכית, משאיר אמין תגובתי לשלב הבא צימוד. להרוות את התגובה עם עודף גדול של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש coverslips ידי אפייה אותם 110 מעלות בתנור למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן methoxy 50:1: תערובת ביוטין PEG ב 100 pH 8.2 mM NaHCO 3. כוון PEG w / v סביב 0.2% biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של התערובת PEG על coverslip מקום silanized יבש אחר coverslip על העליונה. כולל spacer coverslip זכוכית תאפשר הפרדת coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips בפתרון PEG במשך 3 שעות, ואז נפרד כל זוג coverslips בהרחבה ולשטוף עם מים. הקפד לשמור coverslips פונקציונליות כלפי מעלה כמו פעם רק צד יהיה מצופה PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש coverslips ולאחסן תחת ואקום. משטחים להישאר יציב למשך חודש לפחות, כך עשרות coverslips ניתן לבצע אצווה בשימוש לפי הצורך. </li></ol> חומרים אלה צריכים להיעשות מבעוד מועד, ולאחר מכן השתמשו עבור כל ניסוי. כדי להתחיל בניסוי כל מולקולה בודדת, להתחיל בהרכבת תא הזרימה. 3. לשכת תזרים הכנה הניסוי מבוצע באמצעות תא זרימה פשוט בנוי עם coverslip פונקציונליות, פעמיים צדדי קלטת, שקופיות קוורץ צינורות. אחת קאמרית תזרים מוכן לכל מולקולה בודדת 1,4 הניסוי. חומרים: פעמיים צדדי קלטת, סכין גילוח, שקופיות קוורץ עם חורים אפוקסי, מהירה יבש צינורות, coverslip פונקציונליות (ראה לעיל), פתרון streptavidin (25 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל PBS), צינורות, חיץ חסימה (20 mM טריס pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA, 0.005% Tween-20) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין על ידי הנחת 20-25 מ&quot;ל של חיץ חסימת ייבוש להסיר בועות אוויר עבור צעדים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו coverslip PEG-פונקציונליות ולהפיץ 125 של פתרון PBS-בדילול streptavidin על פני השטח. תשאיר את זה דגירה במשך 20 דקות תוך כדי הכנת חלקים אחרים של התא, ומאפשר streptavidin להיקשר biotins פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פיסת פעמיים בצדקלטת ד כדי להתאים את גודל השקופית קוורץ. סמן את המיקום של החורים בצינור בקלטת בעיפרון כך קווי המתאר של החדר תזרים ניתן להסיק בקלטת (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;מ רחב מלבן סביב החורים. זה ישמש ערוץ הזרימה, כדי להיות בטוח כדי להפוך את הצדדים ישר להשאיר מקום סביב כניסת צינורות מוצא. אם תרצה, או ערוצים מרובים בגדלים שונים ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לאורך קו המתאר נמשך, מה שהופך ישר, חתכים נקיים כדי לוודא שלא דבק הבולטת לתוך התעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את אצטון ביסודיות באמצעות קוורץ או אתנול להסיר דבק מן הבנייה תזרים הקודם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את ההיערכות הטובה ביותר המתאר את הערוץ, להסיר צד אחד של גיבוי דבק בזהירות במקום קלטת לשקופית קוורץ. היזהר ליישר את הקלטת כראוי, כמו החורים מפרצון ו לשקע צריכים להישאר חסומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור אורכי צינורות עבור כניסת ו לשקע של התא זרימה. זה עוזר לחתוך את הקצה של הצינור על כ 30 ° זווית כך הצינור לא לחוצים אל תחתית החדר. מניחים את הצינורות על איזה תמיכה להשעות אותם מצורף קל התא זרימה בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslip streptavidin מצופים היטב במים ולייבש באמצעות אוויר דחוס. זכרו כי רק צד אחד הוא פונקציונליות; להיזהר לא להפוך את coverslip נגמר. הסר את הצד השני של קלטת גיבוי במקום שקופיות קוורץ על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ קלות על coverslip כדי לדחוף את כל האוויר שנלכד דבק. זה יעזור למנוע בועות אוויר להיכנס לערוץ הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצדדים של החדר עם אפוקסי. הכנס את צינורות לחתוך לתוך החורים של קוורץ ו חותם במקום עם אפוקסי. זה צריך להתייבש במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש פעם, להתחיל לחסום את פני השטח על ידי משיכת חלק למאגר חסימת degassed דרך אחד הצינורות. מחט מד 21-מתאים באופן מושלם בתוך צינורות 0.76 מ&quot;מ. פלאש כמה פעמים כדי להסיר בועות אוויר, ולאפשר החדר כדי לדגור במשך שעה לפחות חצי. </li></ol> 4. Single-מולקולה שכפול ניסוי חומרים: תא תזרים הוכן, SYTOX אורנג&#39;, מיקרוסקופ TIRF, 532 ננומטר לייזר, מצלמת CCD, מחשב עם תוכנת רכישת התמונה, הרולינג מעגל המצע דנ&quot;א, חלבונים שכפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התא זרימה נחסם, הכל מוכן להתחיל את הניסוי יחיד מולקולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התא זרימה ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ. החזק את תא במקום עם קליפים הבמה להיות בטוח כי ערוץ זרימה ממוקם ישר לאורך ציר ה-Y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התא זרימה מוצא הצינור לשאוב את המזרק באמצעות מחבר צינורות בקוטר גדול יותר או מחט. מניחים את כניסת בחסימת המאגר ולמשוך את הבוכנה כדי להסיר כל האוויר בצינור. קפיצי עדין של הצינור לשקע יעזור ברור כל בועות אוויר שנלכדו בתוך התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תבנית ה-DNA המניות PM ב 25 מ&quot;ל 1 של חיץ חסימה. תזרים לתוך תא בקצב הזרימה מתונה לאפשר כיסוי השטח טוב של ה-DNA. 0.025 מ&quot;ל / דקה במשך 30 דקות פועלת היטב. זו יכולה להיות מגוונת המבוססת על כמה מולקולות הדנ&quot;א הן על פני השטח עבור כל אצווה של coverslips או כמה הם הרצויה עבור הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ה-DNA הוא, לשטוף את ה-DNA העודף באמצעות חסימת חיץ. לשטוף לפחות 200 תזרים תאים כרכים להיפטר מה-DNA של כל תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין degassing החיץ שכפול. עבור א שכפול ניסויים coli, לעשות את זה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הסיכון של בועות בחדר מחומם לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלייזר ואת המצלמה. CCD מקורר צריך להגיע לטמפרטורת לפני שניתן יהיה להשתמש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע הניסוי 37 ° C, להפעיל את החימום. הקפד המטרה היא במגע עם התא זרימה או שזה יהיה גוף הקירור מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה degassing, התגובה יכולה להיות מוכנים. מערבבים נוקלאוטידים, DTT, ו SYTOX במאגר שכפול. לאחר מכן להוסיף החלבונים ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים את תערובת התגובה לתוך התא זרימה. זו מהירות הזרימה צריך להיות מספיק כדי למתוח dsDNA. עבור ערוץ 2 מ&quot;מ רוחב 100 מיקרומטר, תזרים גבוה 0.04 mL / min עובד היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זמן התערובת להיכנס לחדר ולהתחיל הדמיה. עצה טובה היא להעביר את שדה הראיה לצד הערוץ ולהתמקד בחומר דביק. פעולה זו תבטיח שאתה קרוב לפני השטח למיקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת כוח לייזר, להתמקד מיקרוסקופ, וזווית TIRF. שמור על צריכת חשמל נמוכה, כדי למנוע כל photocleavage של ה-DNA מוכתם. רוכשת ב 1-5 מסגרות / שנייה למשך מספר דקות, תלוי בקצב של שכפול הדנ&quot;א. אם תרצה, לחזור כדי לקבל עוד מסלולי שכפול או לעבור לתחום חדש כדי לראות מולקולות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובה תערובת כמעט ריק, זה רעיון טוב לזרום חיץ יותר עם SYTOX לראות בתחומים אחרים של התצוגה. לוקח מספר תמונות של מולקולות שונות משוכפל מספק נתונים סטטיסטיים לקביעת processivity. </li></ol> 5. נציג תוצאות מולקולות שכפול פעיל נתפסים בקלות כקווים הגוברת של ה-DNA מוכתם. בניסויים שלנו, זורם 25 PM המצע M13 נותן 100-1000 מולקולות 60x, בשדה 125 מיקרומטר x 125 מיקרומטר מבט (איור 1). ביצוע ניסויים שכפול באמצעות E. חלבונים coli replisome ב 37 ° C (ראה חומרים לפרטים נוספים) נותן מולקולות 5-50 שכפול לכל שדה הראיה. בריכוזים המקבילה של replisome T7, אשר יוזם על פני המצע ביעילות רבה יותר, אנו צופים&gt; 70% של מולקולות בתוך לשכפל שדה. תנאים אלה תשואה צפיפות מוצר כל כך גבוה מולקולות בודדות שקשה לפתור ולנתח, אז הניסויים T7 מבוצעים בריכוזים חלבון נמוכה יותר. ניתוח נתונים: כדי לקבל קצב נתונים, פשוט העלילה את נקודת הסיום של ה-DNA לעומת זמן לחשב את המדרון (איור 2). עבור processivity, לקבוע את האורך הכולל של ה-DNA. שני המספרים האלה יהיה צורך להמיר זוגות בסיסים. לפני ביצוע הניסוי, אתה צריך לדעת את גודל פיקסל של המצלמה בהגדלה הנכונה. עבור המרה basepair, אמידה טובה היא פשוט המרת מבוסס על אורך קריסטלוגרפיים של ה-DNA, 2.9 נ&quot;ב / ננומטר. עם זאת, זרימה למינרית לא לגמרי למתוח את ה-DNA, כך כיול אורך ה-DNA יבוצעו על ידי לקיחת דנ&quot;א באורך ידוע, למשל 48,502 bp λ DNA, הצמדתו התא זרימה עם אוליגו biotinylated ומדידת אורך SYTOX המוכתמת שלה את קצב הזרימה משמש הניסוי שכפול. קביעת מספר זוגות בסיסים / פיקסל יאפשר חישוב מדויק של שיעור שכפול processivities. לקיחת תמונות וסרטים רבים תספק מספר גדול של מולקולת המוצר, דבר המאפשר לתכנן של הפצות קצב processivity (איור 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: (מתוך המשחק 1.) קריקטורה) של assay מתגלגל מעגל השכפול. (SA, streptavidin). מובילים גדיל סינתזה מרחיב את הזנב המקשר את מעגל פני השטח. הזנב מומר dsDNA ידי פולימראז גדיל מפגרת ומתח על ידי זרימה למינרית. ב) דוגמה שדה הראיה עם SYTOX כתום עירור 532 ננומטר. כתמים ניאון קטנים הם קשורים, שאינם משוכפלים מצעים. הערה אורך קיצונית של המוצרים ואת מספר גדול של מוצרים לכל שדה (כל תא מכיל זרימת&gt; 5000 שדות כאלה). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: (עיבוד שופט 1.) A, b) Kymographs של מולקולות שכפול אופייני T7 (א) ו - E. (ב) coli ניסויים. ג) מסלולי Endpoint של מולקולות מ) A ו-B) זממו נגד הזמן. המסלולים מצוידים רגרסיה ליניארית כדי לקבל שיעורי שכפול. דוגמאות המוצגים הם 99.4 נ&quot;ב s -1 ו - 467.1 bp s -1. ד) הפצות אורך שכפול של מוצרים, שיתאים עם דעיכה מעריכית יחיד להשיג processivity: 25.3 ± 1.7 kbp (T7), 85.3 ± 6.1 kbp (E. coli). ה) הפצות שיעור מסלולי מולקולה בודדת, מתאים עם Gaussians יחיד. אמצעי: 75.9 ± 4.8 נ&quot;ב s -1 (T7), 535.5 ± 39 נ&quot;ב s -1 (E. coli).

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

אחת מלאה קריטי בוחנת את ההשפעה של הכתם, SYTOX אורנג&#39;, על חלבונים שכפול של עניין. דרך פשוטה לעשות זאת היא לבצע את הניסוי שכפול התא זרימה כמתואר אבל עם השמטה של ​​SYTOX. לאחר תערובת תגובה יש זרמו החדר, להוסיף למאגר עם SYTOX להכתים דנ&quot;א לבחון את חלוקת האורך של מולקולות משוכפל. לחלופין, תגובות בתפזורת סטנדרטי יכול לשמש כדי לבדוק השפעה כלשהי על שיעור של SYTOX שכפול ויעילות. הניסוי המתואר כאן משתמשת רק ערוץ זרימה אחת. ניתן לשנות זאת בקלות על ידי יצירת רב ערוצי הזרימה לתאי או באמצעות PDMS או מכשירים microfluidic דומה. הגדלת מספר ערוצי מאוד מקל ההקרנה של ריכוזי חלבון, מוטציות, או מולקולות מעכב ומגבירה את המהירות של אוסף שכפול נתונים. כאמור, אנו מבצעים את ה שכפול coli ניסויים ב 37 ° C באמצעות בית בנוי תזרים אלומיניום תא החימום, גוף חימום התנגדות (דוד מחסנית) ואת אספקת החשמל משתנה. זה נותן יציבות טמפרטורה טובה ומונע את רכישת מחמם אובייקטיבי. כדי לכייל את דוד, אנחנו פשוט קדח חור במרכז התא העליון תזרים קוורץ, תרמי מוכנס לתוך התעלה תזרים זרמו חיץ כרגיל. מדידת טמפרטורת התא זרימה חיץ במתח הגובר מאפשר חימום מדויק.

שכפול T7: 40 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גלוטמט אשלגן 50 מ&quot;מ, 10 מגנזיום כלוריד מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל BSA, עם 5 מ&quot;מ dithiothreitol, dNTPs 600 מיקרומטר, 300 מיקרומטר ATP, CTP 300 מיקרומטר ו 15 ננומטר SYTOX אורנג&#39; הוסיף מיד לפני השימוש. חלבונים מוסף כמו: nM 5 gp4 (hexamer), 40 פולימראז ננומטר (01:01 gp5: thioredoxin), 360 ננומטר gp2.5 1,5. E. coli שכפול: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 מגנזיום אצטט mM, אשלגן כלוריד 80 מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל BSA עם 10 mM dithiothreitol, dNTPs 40 מיקרומטר, 200 rNTPs מיקרומטר ו 15 ננומטר SYTOX אורנג&#39; הוסיף מיד לפני השימוש. חלבונים מוסף כמו: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (מונומר), 30 nM αεθ, 15 ננומטר τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ או τ 3 δδ&#39;χψ, β 30 ננומטר (דימר), 300 ננומטר DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 ננומטר PriA, 40 nM PriB, 320 nM pric, 480 nM DnaT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

אנו מתארים פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוססי בזמן אמת על קיום שיטת שכפול ה-DNA ברמה מולקולה בודדת. תבנית עגולה, DNA מפוצל מחובר coverslip כוס פונקציונליות ו משוכפל בהרחבה לאחר המבוא של חלבונים שכפול נוקלאוטידים (איור 1). גדל פעמיים גדיל DNA מוצר (dsDNA) מתרחבת עם זרימה למינרית ו דמיינו באמצעות צבע intercalating. מדידת המיקום של סוף DNA גדל בזמן אמת מאפשר קביעה מדויקת של קצב שכפול (איור 2). יתר על כן, אורך של מוצרי ה-DNA השלימה דיווחים על processivity של שכפול. ניסוי זה יכול להתבצע בקלות ובמהירות דורש רק מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמה רגישה למדי.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K Views.  Harvard Medical School. פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

Video: Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.