ברצוננו להודות הפוליטכני וורצ&#39;סטר מכון המחלקה לכימיה וביוכימיה למימון.

1. Transfection של שורות תאים Transfection שיטה 1 (Lonza Nucleofection עבור מוגברת יעילות התא הראשוני transfection) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות מעבר האחרונות בצמיחה יומן שלב לפני transfection. שטפו תאים phophate שנאגרו מלוחים (PBS) ותאי הקציר ידי trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6 באר. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. מקום 1.5 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות (במקרה זה מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)) לתוך כל טוב לאזן את התקשורת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי trypsinization ו resuspend בהיקף מינימלי של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים צנטריפוגות את הסכום הנכון של resuspension לספק ~ 5x10 5 תאים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בקפידה 100 הטמפרטורה μL פתרון Nucleofector החדר המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μL ההשעיה תא עם דנ&quot;א 5 מיקרוגרם פלסמיד ולהעביר את המדגם כדי קובט Nucleofector נזהר שלא לכלול בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תוכנית Nucleofector המתאים (זה עשוי לדרוש בדיקה קודמת להקים transfection יעילות אופטימלית עם תמותה מינימלית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט המכיל את ההשעיה תא / דנ&quot;א לתוך המחזיק קובט Nucleofector ולהתחיל בתוכנית שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, להסיר את קובט ולהוסיף ~ 500 μL של טרום equilibrated התקשורת בתרבות אליו (נלקח מתוך צלחת 6-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הדגימה לתוך צלחת 6-היטב עם נפח סופי של 1.5 מ&quot;ל לכל טוב. תאים צריכים להיות מצופה באחת אוכלוסיות מעורבות או בנפרד, עבור פקדי. </li></ol> Transfection שיטה 2 (Qiagen transfection Effectene עבור שורות תאים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מתחמי transfection באמצעות מגיב Effectene Qiagen ידי הראשון מוסיף 0.8 מיקרוגרם של כל דגימה DNA פלסמיד למאגר 200 EC μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.4 μL מגיב משפר מדגם זה, מערבבים בקצרה על ידי מצליף את הצינור, ואת דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מגיב Effectene μL לערבב כל המדגם, על ידי מצליף את הצינור, ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה זה, להכין את שתי שורות תאים של עניין transfection. שטפו תאים passaged לאחרונה (&lt;80 מפגש%) פעם שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). הוסף גב 1.5 טרי מ&quot;ל התחמם equilibrated צמיחה בינוני (במקרה זה שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתחמי transfection יש מודגרות למשך 15 דקות, להעביר 1.2 מ&quot;ל של התקשורת מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting, ומיד להעביר ~ 700 μL של קומפלקסים לכל אחד שתי בארות בצלחת 6-הבאר. הוסף dropwise, ומערבבים בעדינות ידי על ידי מתערבל את הצלחת. אפשר התאים transfect לפחות 3 שעות (עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6-באר חדשה. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים יש transfected, לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולאסוף את התאים על ידי trysinization מינימלי על ידי הוספת כ -100 פתרון טריפסין μL זה טוב, בקצרה להסעיר את הצלחת מעיל מלא כל טוב, ומיד aspirating את טריפסין. ברגע שהתאים נוקף, להוסיף 1.5 התקשורת טרי מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, התאים צריכים להיות מצופה באוכלוסיות או מעורבת או נפרדת (עבור פקדי) על גבי תלושי כיסוי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לשחזר את התאים למשך 12 שעות. </li></ol> 2. תא Fusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה תרבות מן התאים ולשטוף פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, מומלץ לטפל בתאים עם cycloheximide (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לעכב את סינתזת החלבון. אפשר התאים כדי לדגור על 2 שעות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיך תאים על ידי חשיפת אותם בתמיסה של 50% פוליאתילן גליקול 1000 (PEG 1000) בסרום ללא DMEM עבור 125 שניות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם PBS להסיר את הפתרון 1000 PEG, ולהוסיף 2 מ&quot;ל חימם טרי התקשורת equilibrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים כדי לדגור במשך 18 - 24 שעות. </li></ol> Fluorescence מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה והתרבות, לשטוף את התאים פעמיים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) היטב כל אחד. להתסיס בעדינות במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע פעמיים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת, הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת הרכבה בינונית (90% גליצרול, 100mm טריס pH 7.5, DABCO 2% (1,4-diazabicoyclo אוקטן) DAPI המכיל (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הרכבה עודף משקופיות, ואת החותם שיתוףver מחליק עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal או epifluorescence. </li></ol> 3. נציג תוצאות תרשים 2 מציג דוגמה heterokaryon הניסוי באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים סרטן ריאות מסוג תאים תאים. החלבון של עניין בניסוי הזה (אנמיה עוף Virus-VP3) מציג לוקליזציה cytoplasmic בעיקר סוגי תאים ראשוניים לוקליזציה גרעיני סוגי תאים טרנספורמציה כמו דמיינו ידי מיקרוסקופיה epifluorescence. החלבון מבוטא היתוך כדי או GFP (pEGFP-N1 וקטור, Clontech) ב fibroblasts העורלה הראשי (קרן היסוד) או dsRed (dsRed-N1 וקטור, Clontech) ב H1299 תאים. דגימות בקרת מעורבים עצמית fusions (שתי שורות למעלה) להציג תאים multinucleated ללא שינוי היציב דפוסי לוקליזציה. שינויים כאלה שעלולות להתרחש עקב רגישות לתנאי היתוך או היווצרות של syncitia. Fusions Heterokaryon (השורה התחתונה) להפגין כניסה הגרעיני של חלבון ה-GFP-התמזגו תאים שמקורם הראשוני colocalization עם חלבון dsRed-התמזגו בתגובה הקדמה של חומר תא שינה. הדוגמה המוצגת היא שילוב heterokaryon נדיר יחסית הנובעת רק שני תאים, אחד מכל סוג, כפי שמודגם על ידי נוכחות של שני אותות fluoroprotein. בנוסף לגילוי סוגים אלה של מעברים לוקליזציה, פעילות הלוך ושוב nucleocytoplasmic ניתן לאתר בקלות על ידי נוכחות של fluorophore יחיד גרעינים שניהם. זה סוג של נחישות ברורה כאשר בוחנים 01:01 fusions התא תלוי עיכוב של התרגום. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים זרימה של השיטה heterokaryon באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים קרצינומה של תאים סלולריים. הגן של עניין הוא משובטים כדי לייצר היתוך מסגרת אחת של שני גנים חלבון פלואורסצנטי. קווים סלולריים הם אז transfected transiently עם לבנות או ואיפשר להתאושש. היווצרות Heterokaryon הוא המושרה על ידי טיפול קצר עם פוליאתילן גליקול (PEG) ואחריו דגירה נוסף. לבסוף, לוקליזציה המשנה הסלולר של החלבון של עניין הוא ציין באמצעות צורות שונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סחר Nucleocytoplasmic ו הלוך ושוב פעילות של חלבון אנמיה עוף וירוס VP3 דמיינו ידי היתוך heterokaryon. שורה עליונה: תמונות נציג עצמית התמזגו H1299 תאים להביע dsRed-VP3 שורה התיכון:.. תמונות epifluorescence נציג העיקרי תאים פיברובלסטים העורלה (קרן היסוד) להביע את ה-GFP-VP3 לאחר היתוך PEG שורה תחתונה: פיוז&#39;ן Heterokaryon של קרן היסוד ו H1299 תאים. צהוב עולה colocalization-GFP אותות dsRed. תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי AF6000E לייקה לייקה ותוכנות הדמיה.

<ol>
	<li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins.">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li><li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li><li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP/NXF1.">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li><li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus.">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li><li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+Hormone+Receptor+&#945;1+Follows+a+Cooperative+CRM1/Calreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway.">Thyroid Hormone Receptor &#945;1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li><li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization,+Apoptosis,+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex/Cyclosome+to+PML+Bodies.">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li><li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization.">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li><li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2/M+regulators+in+yeast.">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li><li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function.">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li><li>Lin, X. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RXR&#945;+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells.">RXR&#945; acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li><li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation.">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li><li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus.">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול heterokaryon המובא כאן מספק שיטה יעילה לפרש בקלות עבור אפיון של התנהגות מסוג מסוים לוקליזציה התא וכן פעילות nucleocytoplasmic הלוך ושוב. שיטה זו מנצלת את הרגישות של ניתוח הקרינה, כמו גם את היכולת תאים התמונה לחיות ולבצע מחקרים של הדינמיקה חלבון. הטכניקה היא מותאמת בקלות הרבה סוגי תאים שונים, והוא מקובל גם הדמיה תא חי וקבוע. לדוגמה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך יכול לשמש הדמיה לחיות זמן לשגות לכידת וידאו. לעומת זאת, התאים רכוב ניתן להשתמש במיקרוסקופ או epifluorescence לקביעת מצב יציב לגרסאות המגוירות או הדמיה confocal מפורטת יותר של לגרסאות המגוירות בדידים. יתר על כן, טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), או הפסד הקרינה photobleaching (FLIP) יכול לשמש בקביעת קינטיקה לוקליזציה 1. שילוב של fluorophores חלופי בפרוטוקול תאפשר אינטראקציה ניסויים כגון חלבון פלואורסצנטי תהודה העברת אנרגיה (סריג), שתבוצע בקונצרט 2. מעכבי שונים של סחר בבני הסלולר כגון B leptomycin או דומיננטי שלילי רן בונה GTPase ניתן להשתמש כדי להקים את התלות ביבוא מסוים או מסלולים יצוא 5,6,9. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים מסוימים מעורבים בפעילות הלוך ושוב, יש להקפיד כדי למנוע תופעות לוקליזציה בשל סינתזה של חלבונים חדשים. במקרים אלה, מעכבי תרגום או נקודות זמן מוגבל חייב לשמש. עם זאת, הממצאים בשל עיכוב translational להישאר אפשרות. Fusions תא המכיל אחד מכל סוג התא המבוקש ביותר לפרשנות ברורה של הלוך ושוב והתנהגות לוקליזציה. אופטימיזציה של מספר תאים התנאים היתוך (תזמון וריכוז) עשוי להיות נחוץ כדי לקדם אירועים כאלה נוחים 01:01 היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין כי אופטימיזציה של צעדים מסוימים בפרוטוקול יהיה צורך בהתאם לסוגי תאים מסוים בשימוש. היבטים בהליך ניסיוני כגון איחוי יעילות, יעילות transfection, ואת הכדאיות לאחר המיזוג עשוי להשתנות במידה רבה בין סוגי תאים. בפרט, סוגי התאים העיקריים יכול להיות מאתגר לנהל בשל התנאים תרבות מורכבת transfection יעילות נמוכה. שימוש בטכנולוגיות כגון מכשיר Lonza Nucleofector יכול לאפשר עיבוד מהיר של התאים, כמו גם יעילות transfection עלה באופן דרמטי. בנוסף, שיטות electroporation לאפשר העברה קלה של תאים השעיה אל השלבים הבאים היתוך. </li></ul>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3023602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified Eagle&#x2019;s medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH30243FS</td>
<td>High glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FisherChemical</td>
<td>O4042-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D9542-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyclone Serum (fetal bovine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH3008803HI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Falcon 6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>528875-25GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DABCO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2522-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector HDF kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>VPD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

heterokaryon technique for analysis of cell type-specific localization

מספר משמעותי של חלבונים מוסדרים על ידי סחר subcellular או nucleocytolasmic הלוך ושוב. חלבונים אלה להציג מגוון רחב של תפקודים תאיים כולל לייבא גרעיני / יצוא של רנ&quot;א וחלבונים, תקנה תעתיק, ו אפופטוזיס. מעניין, וארגון מחדש הסלולר הגדולות, כולל חלוקת התא, בידול ושינוי, לעתים קרובות כרוך פעילויות כגון 3,4,8,10. מחקר מפורט של החלבונים האלה מנגנוני הרגולציה שלהם יכול להיות מאתגר כמו גירוי על שינויים אלה לוקליזציה יכול להיות חמקמק, והתנועות עצמם יכולים להיות דינמי די קשה לעקוב. מחקרים שכללו oncogenesis הסלולר, למשל, ממשיכים ליהנות מסלולים הבנה ופעילויות חלבון שונים בין תאים ראשוניים נורמליים ותאי שינה 6,7,11,12. כאשר חלבונים רבים מראים לוקליזציה שינו במהלך טרנספורמציה או כתוצאה של שינוי, שיטות כדי לאפיין ביעילות אלה חלבונים המסלולים שבהם הם משתתפים עומדים לשפר את ההבנה של oncogenesis ושטחים פתוחים תרופה חדשה המיקוד. כאן אנו מציגים שיטה לניתוח סחר חלבון הלוך ושוב בין פעילות בתאי יונקים העיקרי והפך. שיטה זו משלבת את דור fusions heterokaryon עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספק פרוטוקול גמיש שניתן להשתמש בהם כדי לזהות לגרסאות המגוירות חלבון היציב או דינמי. כפי שמוצג באיור 1, שני סוגי תאים נפרדים transfected transiently עם בונה פלסמיד הנושא גן fluoroprotein המצורפת הגן של עניין. אחרי הביטוי, התאים הם התמזגו באמצעות פוליאתילן גליקול, ואת לגרסאות המגוירות חלבון עלול אז להיות צילמו באמצעות מגוון של שיטות. הפרוטוקול המובא כאן הוא גישה בסיסית אשר בטכניקות מיוחדות ניתן להוסיף.

Watch this Scientific Journal Video about Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization at JoVE.com

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

שיטה גמישה ויעילה לאפיון של לוקליזציה סוג ספציפי חלבון התא nucleocytoplasmic הלוך ושוב מתואר. גישה זו משתמשת heterokaryon חלבונים היתוך fluorescently-שכותרתו לגרסאות המגוירות חלבון תמונה לאחר איחוי תאים. פרוטוקול ניתנת היציב לגרסאות המגוירות או קביעות יותר דינמי המבוסס על הדמיה תא חי.

Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

heterokaryon-technique-for-analysis-of-cell-type-specific-localization

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Views.  Worcester Polytechnic Institute- WPI. שיטה גמישה ויעילה לאפיון של לוקליזציה סוג ספציפי חלבון התא nucleocytoplasmic הלוך ושוב מתואר. גישה זו משתמשת heterokaryon חלבונים היתוך fluorescently-שכותרתו לגרסאות המגוירות חלבון תמונה לאחר איחוי תאים. פרוטוקול ניתנת היציב לגרסאות המגוירות או קביעות יותר דינמי המבוסס על הדמיה ת?...

Video: Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for generation of transgenics for in vivo imaging. These unique capabilities make the zebrafish an ideal platform to study ocular lens development and physiology. Our recent findings that an Aquaporin-0, Aqp0a, is required for stability of the anterior lens suture, as well as for the shift of the lens nucleus to the lens center with age led us to develop tools especially suited to analyzing the properties of zebrafish lenses. Here we outline detailed methods for lens dissection that can be applied to both larval and adult lenses, to prepare them for histological analysis, immunohistochemistry and imaging. We focus on analysis of lens suture integrity and cortical cell morphology and compare data generated from dissected lenses with data obtained from in vivo imaging of lens morphology made possible by a novel transgenic zebrafish line with a genetically encoded fluorescent marker. Analysis of dissected lenses perpendicular to their optical axis allows quantification of the relative position of the lens nucleus along the anterior-posterior axis. Movement of the lens nucleus from an initial anterior position to the center is required for normal lens optics in adult zebrafish. Thus, a quantitative measure of lens nuclear position directly correlates with its optical properties.

These protocols were developed to analyze cortical lens morphology, structural integrity of the zebrafish lens sutures in fixed and live lenses and to measure the position of the zebrafish lens nucleus along the anterior-posterior axis.

הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...