עבודה במעבדה מונטגומרי על התגובות phytochrome בצמחים נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק לא. MCB-0919100 כדי BLM) ומדעי כימית, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד החוץ האמריקני אנרגיה (ללא מענק. DE FG02 91ER20021 כדי BLM). אנו מודים מליסה ויטאקר לקבלת סיוע טכני במהלך הצילומים אנושות בקריאת כתב היד, סטפני קוסטיגן לסיוע הניסוי, ד&quot;ר לואיס המלך לסיוע בפיתוח ואופטימיזציה הקרינה המופעל Cell מיון פרוטוקולים למיון protoplast ארבידופסיס מסגרת ד&quot;ר מלינדה לסיוע עם confocal במיקרוסקופ. אנו מודים מרלן קמרון לסיוע עיצוב גרפי בירד קרן לסיוע העריכה.

1. הצמח צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אושר כטב&quot;מ-BVR GAL4 X-GFP קו משפר מלכודת מבודד כמתואר 4 (לסיכום ראו איור. 1) וקווי wild-type או ההורים נזרעים על קרקע, כלומר ~ 2000 זרעים מעוקרים בכל שורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמחים גדלים במשך 5 שבועות על אדמת תחת תאורה לבנה של 100 μmolm -2 s -1 ב 22 ° C ו 70% לחות. </li></ol> 2. ליף Protoplast בידוד (עיבוד Denecke ו Vitale 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד protoplasts, להכין TEX חיץ. עבור חיץ 1 ליטר TEX, לשקול את הרכיבים הבאים: 3.1 גרם של Gamborg B5 מלחים, 0.5 גר &#39;2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES, 2.56 מ&quot;מ), 0.75 כלוריד גרם סידן dihydrate (CaCl 2 .2 H 2 O, 6.75 מ&quot;מ), 0.25 גרם אמוניום חנקתי (NH 4 NO 3, 3.12 מ&quot;מ), סוכרוז 136.9 גרם (0.4M). להמיס מרכיבים לחלוטין ~ 900 מ&quot;ל מים מזוקקים deionized (DDH 2 O) ולהביא את רמת החומציות ל 5.7 עם 1 M KOH. תביאו נפח סופי 1 ליטר ולסנן לעקר עם בקבוק העליונה לסנן 0.2 מיקרומטר מחוברת משאבת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ירוק, עלים בריא מצמחים (~ 250 מ&quot;ל של עלים ארוזים בצורה רופפת בכוס) ולשטוף עם ~ 40 מ&quot;ל DDH 2 O 4 פעמים, ואחריו שטיפה פעמיים עם סטרילי DDH 2 O. באמצעות # 20 אזמל, עלים לחתוך לרצועות דקות ומחלקים רקמות שווה לשני 50 מ&quot;ל סטרילי צינורות פלסטיק. הכינו תערובת עלים 1x העיכול על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של aliquot העיכול 10x פתרון המניות עלה (עלה 10x העיכול פתרון המניות: להמיס 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v cellulase &quot;Onozuka&quot; R-10 ב TEX חיץ, מסנן לעקר עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהקפיא aliquots 5 מ&quot;ל ב -80 ° C) עד 45 חיץ טרי מ&quot;ל TEX. הוסף ~ 25 מ&quot;ל של תערובת 1x עלה לעיכול לכל שפופרת 50 מ&quot;ל כדי לכסות את כל רקמת העלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור לרקמות עלה בתערובת עיכול צינורות פתוחים שעות 1 בטמפרטורת החדר באמצעות ייבוש ואקום מחוברת משאבת מים ואחריו הדגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עם רעד עדין. צינורות כתרים עם רקמת עלה בתמהיל עלה 1x העיכול נשמרים עטוף בנייר אלומיניום במהלך תהליך זה, כדי למנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 שעות, להגדיל את מהירות הנדנדה ~ 2 דקות כדי לשחרר protoplasts. סנן את ההשעיה protoplast גולמי באמצעות שתי שכבות של בד גבינה סטרילי להסיר פסולת ולאסוף את תסנין בכוס כוס סטרילית. סינון תסנין באמצעות רשת של 100 מיקרומטר סטרילי ניילון לתוך צלחת פטרי סטרילית. איסוף לזרום ולהעביר אותו צינור חדש 50 מ&quot;ל סטרילי. השתמש בערך 15-20 מ&quot;ל של חיץ TEX טרי לשטוף את צלחת פטרי סטרילית ולאסוף כל protoplasts דבקות אל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הזרימה דרך הרוטור באמצעות דלי הנדנדה ב 100xg על 10 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (האצת 6, להאטת 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ~ 25-30 מ&quot;ל של הנוזל מתחת לשכבת protoplast צף, אשר מכיל שיירי פסולת ו pelleted, עם סטרילית 9 &quot;זכוכית פסטר פיפטה מחוברת משאבה peristaltic מבלי להפריע את השכבה protoplast צף והשארת ~ 10-15 נפח מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ חדש TEX לנפח סופי של 40 מ&quot;ל בזמן בעדינות resuspending protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.5-2.7 פעמיים כדי להסיר שאריות הסלולר כמה שיותר. השעה צנטריפוגה מצטמצם 10 דקות החזרה הראשונה עד 5 דקות חזרה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב protoplasts צף עם חתך, פיפטה סטרילית 1 מ&quot;ל להעביר לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל חדש. המשך ישר למיון או לאחסן בחושך עד 2 שעות 4 ° C עד המיון. </li></ol> 3. Protoplast מיון לפי מיון הקרינה המופעל תא (FACS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מיון, לבחון protoplasts ידי מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) באמצעות לייזר 488 ננומטר עבור עירור לאשר שלמות protoplast ואת הנוכחות של ה-GFP הקרינה בבריכה protoplast. פסולת מינימלי הכרחי כדי למנוע סתימת הנחיר FACS מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין protoplasts מבודד TEX חיץ באמצעות FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) באמצעות זרבובית 200 מיקרומטר על ראשו מעין מאקרו בשיעורים אירוע בין 6000 ו - 15000, עם לחץ מערכת של סביב 9 psi בעקבות פרוטוקול מותאם 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Wild-type GFP protoplasts שאינם משמשים כדי לקבוע את ספי autofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף GFP חיובי protoplasts, סוג התאים באמצעות מקורר אוויר ארגון לייזר (ספקטרה לפיסיקה דגם 177, ניופורט Corporation, אירווין, קליפורניה) פעלו mW 100 בקו ארגון 488 ננומטר לזהות GFP הקרינה באמצעות הלהקה 530/30 עוברים סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אוסף ה-GFP חיובי protoplasts, לבחון protoplasts מיון לפי CLSM כמפורט צעד 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית RNA הכולל protoplasts מיון באמצעות RNeasy Qiagen קיט מיני צמחים. cDNA אז יכול להיות מוכן הכלאה כמתואר Affymetrix GeneChip Exprניתוח טכני ession ידנית ואז הכלאה כדי AtH1 מערכים ארבידופסיס Affymetrix הגנום כולו. </li></ol> נציג תוצאות גילינו מספר משמעותי של ה-GFP חיובי תאים בערוץ ה-GFP על ידי FACS (איור 2). ב מבחני אופטימיזציה באמצעות GFP-משפר מלכודת ההורים, constitutively GFP-לבטא קו, J0571, מוצג ~ 17% עד 24% GFP חיובי protoplasts, ואילו קו עם הביטוי של כלי הדם ואת עורי, J1071, היה ~ 1.4% GFP חיובי protoplasts (טבלה 1). מיון של μl 500 x 3 (~ 1.5 סך של השעיה protoplast מ&quot;ל) של J0571 protoplasts עבור 1 ש נתן ~ 100,000 GFP חיובי protoplasts. מיון של μl 500 x 3 (~ 1.5 השעיה protoplast מ&quot;ל סה&quot;כ) של J1071 protoplasts עבור 1.5 שעות נתן ~ 3000 GFP חיובי protoplasts. תמונות Confocal הצביעו על תשואה גבוהה מאוד של protoplasts עבור דגימות הן J0571 ו J1071 לפני המיון בוצעה (איור 3C ו 3E), וכן שברים מיון הכלול בהיר רק GFP-פלורסנט protoplasts (איור 3G ו מידע לא מוצג). ממצא זה מאשר כי פגע GFP חיובי protoplasts ניתן למיין באמצעות FACS. לא ה-GFP protoplasts ניתן גם למיין ואסף בערוץ נפרד. הלא GFP protoplasts לשמש מלאה שלילי אידיאלי עבור מנתח microarray הבאים כדי לזהות שינויים ספציפיים ביטוי גנים על הפחתת רמות holophytochrome. RNA חילוץ מתוך protoplasts מבודדים (1 מ&quot;ל) תשואות של RNA בכמות מספקת לגילוי על ידי fluorospectrometry (איור 4). מבודדים רנ&quot;א הוערכה באמצעות מכשיר NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) לכמת ידי תוכנת NanoDrop RNA 3.7.1 כימות. התשואות RNA מן טרום מיון C24 wild-type protoplasts או FACS, מיון, GFP חיובי protoplasts משפר מלכודת חרג מינימום 20 ng צורך לשימוש ב-RNA-תיוג מבחני עבור microarray (טבלה 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Enhancer קו מלכודת </td><td> % של ה-GFP חיובי protoplasts </td><td> מספר protoplasts GFP מיון </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17.18% ~ 24.06% </td><td> 26,400 ~ 36,000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1.43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. אחוז GFP חיובי protoplasts משתי שורות משפר מלכודת לפני למיון מספר GFP חיובי protoplasts שנאספו על ידי הפעלת 500 μL ההשעיה protoplast באמצעות סדרן Cell הקרינה הופעל (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הצמח קו </td><td> RNA תשואה (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71.5 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. תשואה מהבידוד RNA מן protoplasts. RNA היה מבודד טרום מיון C24-GFP חיובי protoplasts wild-type או מיון של שתי שורות משפר מלכודת לכימות. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. GAL4 משפר-מלכודת מבוססי אינדוקציה של Biliverdin רדוקטאז (BVR) ביטוי הצמחים הטרנסגניים thaliana ארבידופסיס. (א). בודדים נבחרים מספריה של GAL4 מבוססי קווי משפר מלכודת, אשר מכילים GAL4 מגיב סמן גן ה-GFP, ניתן חצה קו המכיל את הגן GAL4 מגיב מטרה לגרום הביטוי של הגן היעד GAL4 המכיל תאים מסומנים על ידי ה-GFP פלואורסצנטי. מבוסס על דמות של ד&quot;ר ג&#39;ים Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (ב) הפקה של phytochrome chromophore, phytochromobilin (PΦB) ו holophytochrome בקווים האב. (ג) משמאל, הפחתת biliverdin IXα (BV IXα) ו PΦB ידי biliverdin רדוקטאז (BVR) פעילות BR ו PΦR, בהתאמה. תוצאות BVR פעילות דלדול PΦB ומובילה לירידה בייצור של photoactive holophytochrome. נכון, התגובה catalyzed ידי BVR מוצג. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Cell Fluorescence מיון פעיל (FACS) נקודה רכישת חלקות. השוואה בין תא protoplast מיון עבור סוג C24 בר (א), J0571 (ב) ו J1071 (C). (א) נקודה רכישת חלקה של אי - GFP פלורסנט C24 wild-type protoplasts נרגש 488 ננומטר ארגון לייזר בשימוש כדי לקבוע סף autofluorescence. (ב) ו - (ג) נקודה מגרשים רכישת להראות הפרופורציות של protoplasts כי הם GFP חיובית בתגובה עירור על ידי לייזר 488 ננומטר. שערי מיון R3 ב B ו-C לתחום את ה-GFP חיובי מטרות שהיו מיון לפי סדרן הקרינה המופעל תא (FACSVantage, BD) ואסף. ערוץ האדום מציין values ​​עבור autofluorescence כלורופיל מ protoplasts ערוץ ירוק מציין ערכי ה-GFP פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מיקרוסקופיה confocal של protoplasts צמח המשמש למיון התא. Confocal לייזר סריקת תמונות של protoplasts לפני (A, C, E) לאחר מיון (G) באמצעות סדרן הקרינה המופעל תא (FACS). B, D, F ו-H הם תמונות DIC. Protoplasts מסוג C24 בר (A, B), J1071 (C, D) ו J0571 (E, F, G, H) מוצגים. תמונות C, E ו-G ימוזגו תמונות של ה-GFP פלואורסצנטי (BP 505 nm - 575 ננומטר) autofluorescence (LP 650 ננומטר) המתקבל עירור עם לייזר 488 ננומטר. באמצעות H הם ממוצע של 4 סריקות תחת שמן 63x. בר = 10 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. כימות RNA שבודד protoplasts ידי fluorospectrometry. RNA המופק מסוג C24 (A) בר, (ב) J0571, ו (ג) J1071. מציינת רנ&quot;א עבור טרום מיון wild-type protoplasts. B ו-C מעידים RNA מ-GFP חיובי protoplasts מיון לפי מיון הקרינה המופעל תא (FACS). RNA תוכנה כימות, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

<ol>
	<li>Franklin, K. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+functions+in+Arabidopsis+development.">Phytochrome functions in Arabidopsis development.</a> J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).</li><li>Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+place,+right+time:+Spatiotemporal+light+regulation+of+plant+growth+and+development.">Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development.</a> Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).</li><li>Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4-GFP+enhancer+trap+lines+for+genetic+manipulation+of+lateral+root+development+in+Arabidopsis+thaliana.">GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).</li><li>Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-localized+phytochrome+chromophore+synthesis+is+required+for+tissue-specific+photoregulation+of+root+elongation+and+impacts+sensitivity+to+jasmonic+acid+in+Arabidopsis+thaliana.">Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana.</a> , .</li><li>Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photomorphogenesis+by+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Cell. , 675-688 (1997).</li><li>Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+distinct+aspects+of+photomorphogenesis+via+targeted+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).</li><li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+spatial-specific+phytochrome+responses+using+targeted+expression+of+biliverdin+reductase+in+Arabidopsis.">Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).</li><li>Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+anthocyanin+accumulation+and+phytochromes+in+Arabidopsis+thaliana.">Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana.</a> , .</li><li>Denecke, J., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protoplasts+to+study+protein+synthesis+and+transport+by+the+plant+endomembrane+system.">The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system.</a> Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).</li><li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+expression+profiling+in+plants+via+cell+sorting+of+protoplasts+from+fluorescent+reporter+lines.">Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines.</a> Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+control+of+Arabidopsis+development+entails+coordinated+regulation+of+genome+expression+and+cellular+pathways.">Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways.</a> Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).</li><li>Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+signal+transduction+in+higher+plants.">Light signal transduction in higher plants.</a> Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).</li><li>Ulm, R., &amp;amp, N. a. g. y., F, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+and+gene+regulation+in+response+to+ultraviolet+light.">Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+Arabidopsis+genome+during+development.">Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development.</a> Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).</li><li>Neff, M. M., Fankhauser, C., &amp;amp, C. h. o. r. y., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light:+an+indicator+of+time+and+place.">Light: an indicator of time and place.</a> Genes Dev. 14, 257-271 (2000).</li><li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root.">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li></ol>

התבטאות גנים באמצעות פרופיל microarrays (1) ציין כי יותר מ -30% מכלל הגנים שתילים ארבידופסיס הם 11 מוסדר אור (2) זיהה קבוצה המכריע של הגנים המקודדים חלבונים אור הולכת אותות מעורבים phytochrome איתות מפל 12, 13 . ניסויים אלה מראים כי האור גורם לשינויים מהירים לטווח ארוך ביטוי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-BVR antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QED Bioscience Inc.</td>
<td>56257-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase &#x201C;Onozuka&#x201D; R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>MSPC 0930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg&#x2019;s B5 basal salt mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>PTC 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES, low moisture content</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M3671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog salts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>74904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytablend</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>28302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Plant Minikit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>16419</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

investigating tissue- and organ-specific phytochrome responses using facs-assisted cell-type specific expression profiling in arabidopsis thaliana

מתווכת אור מערך של תהליכים התפתחותיים אדפטיבית לאורך כל מחזור החיים של צמח. צמחים לנצל אור קליטת מולקולות בשם photoreceptors לחוש ולהתאים לאור. אדום / מרחיקות אדום אור קליטת photoreceptors phytochrome נחקרו רבות. Phytochromes להתקיים כמשפחה עם פונקציות של חלבונים שונים וחופפים בכל המערכות צמח גבוה שבו הם נחקרו<sup&gt; 1</sup&gt;. Phytochrome בתיווך התגובות אור, אשר נע בין נביטת הזרעים דרך פריחה הזדקנות, הם לעתים קרובות מקומי לרקמות צמחים או איברים ספציפיים<sup&gt; 2</sup&gt;. למרות גילוי הבהרה של פונקציות phytochrome הפרט מיותר מוטציוני באמצעות ניתוחים, דוחות חותכת באתרים שונים של photoperception ואת המנגנונים המולקולריים של בריכות מקומי של phytochromes כי לתווך מרחבית ספציפית התגובות phytochrome מוגבלים. עיצבנו הניסויים מבוסס על השערות כי אתרים ספציפיים של photoperception phytochrome להסדיר רקמות איברים ספציפיים ההיבטים של photomorphogenesis, וכי בריכות phytochrome מקומית לעסוק תת ברורים של גני מטרה במורד הזרם איתות התא אל התא. פיתחנו גישה ביוכימית סלקטיבי להפחית phytochromes פונקציונלי של איבר או רקמה ספציפית בצורה בתוך הצמחים הטרנסגניים. המחקרים שלנו מבוססים על גישה, משפר מלכודת bipartite כי התוצאות transactivation הביטוי של הגן תחת שליטה של ​​האלמנט Upstream רצף (כטב&quot;מ) הפעלה על ידי activator תעתיק GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. Biliverdin רדוקטאז (<em&gt; BVR</em&gt;) הגן תחת שליטתו של כטב&quot;מים נשמר בשקט בהעדר transactivation GAL4 ב הורה כטב&quot;מ-BVR<sup&gt; 4</sup&gt;. חוצה גנטי בין קו מהונדס כטב&quot;מ-BVR ו GAL4-GFP קו משפר מלכודת לגרום הביטוי הספציפי של<em&gt; BVR</em&gt; גנים בתאים מסומנים<em&gt; GFP</em&gt; ביטוי<sup&gt; 4</sup&gt;. BVR הצטברות בתוצאות צמחי ארבידופסיס על מחסור chromophore phytochrome<em&gt; ב Planta</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. לכן, הצמחים הטרנסגניים כי הפקנו GAL4 תלויי התערוכה ההפעלה של<em&gt; BVR</emהגן&gt;, וכתוצאה מכך איון ביוכימי של phytochrome, כמו גם GAL4 תלויי<em&gt; GFP</em&gt; הביטוי. ניתוח גנטי Photobiological מולקולרית של<em&gt; BVR</em&gt; קווי מהונדס הם מניבים תובנה רקמות איברים ספציפיים phytochrome בתיווך תגובות קושרו עם אתרי המקביל photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) של ה-GFP חיובי, משפר, מלכודת-Induced<em&gt; BVR</em&gt;-לבטא protoplasts צמח יחד עם פרופיל תא מסוג ספציפי גן ביטוי באמצעות ניתוח microarray נמצא בשימוש כדי לזהות המשוערת גני מטרה במורד הזרם מעורב בתיווך מרחבית ספציפית התגובות phytochrome. מחקר זה מרחיב את ההבנה שלנו של אתרי תפיסת האור, את המנגנונים שבאמצעותם רקמות או איברים שונים לשתף פעולה צמיחה אור מוסדר צמח ופיתוח, קידום לנתיחה מולקולרית של phytochrome בתיווך מורכב תא אל תא האיתות מפלי.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

investigating-tissue-organ-specific-phytochrome-responses-using-facs

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

15.7K Views.  Michigan State University (MSU). הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעור...

Video: Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

מחבר זרקור: ברזולוציה גבוהה, גרגר יחיד, In Vivo אבקה הידרציה bioassay עבור Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

בדיקה ביולוגית ברזולוציה גבוהה, מדגן יחיד, In Vivo אבקת הידרציה עבור Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...