עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.

1. הפריטים צריכים להיות מוכנים לפני שתמשיך ציפוי נייד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח מתאים של המדיום המל&quot;ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot של בינונית NeuroCult סרום ללא NCFC ללא ציטוקינים הינו מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדיום הוא התחמם בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות במלאי של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), הצמיחה הבסיסית גורם fibroblastic (ב-FGF) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - הפרין ב -0.2% מוכנים מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לגודל הניסוי, מספר 35mm תרבות מנות רקמה יש צורך בתאים צלחת אחת 150-200cm פלסטיק צלחת פטרי נחוץ גם כדי להחזיק את הכלים 35mm כפולות צלחת 35mm שלישי מים. </li></ol> 2. תא הכנה: בהתאם הניסוי שלך, תאים יכולים להיות מוכנים ממקור מבוגר או עובריים (רקמה ניתק ראשוני או neurospheres ניתק). לנתח רקמות מן הבוגרים / עכבר עובריים במערכת העצבים המרכזית (CNS) או לנתק neurospheres מבוגר / עובריים שמקורם כפי שתואר לפני 1,2 ואז: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיית תא בודד עובר דרך פילטר של 40 מיקרומטר בגודל רשת כדי להסיר אי - ניתק גושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90μl של Trypan כחול לבצע ספירת תאים. הערה: דילולים אחרים בתא המתאים יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה משתמש עובריים ראשוני או מבוגר תאים עצביים שמקורם, לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 6.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל במדיום המל&quot;ל להשלים. אם באמצעות תאים neurospheres ניתק נגזר תאים עצביים למבוגרים או עובריים, לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 2.2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל במדיום המל&quot;ל להשלים. </li></ol> 3. ציפוי תאים בינוני N-CFCA חצי מוצק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכרך המתאים את הרכיבים הבאים מעורבת כדי, תלוי במספר משכפל. כאן אנו לערבב את הסכום הדרוש עבור שני משכפל או לשכפל הכלים. עבור מספרים נוספים של משכפל, עיין בטבלה 1. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.7 מ&quot;ל של מדיום NeuroCult סרום ללא NCFC ללא ציטוקינים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 330 μL של NeuroCult תוספי NSC הפצת נשק גרעיני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.6 μL של EGF (10μg/mL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 32 μL של פניצילין / סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.3 μL של b-FGF (10μg/mL) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.3 μL של הפרין (0.2%) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25μL ההשעיה תאים (של 2.2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל תאים מן neurospheres ניתק או 6.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל תאים ראשוניים מרקמת ניתק CNS). הערה: המספרים התא מצופה הסופי צריך להיות בערך 2500 תאים לכל צלחת 35 מ&quot;מ תרבות עבור תאים שמקורם neurosphere ו 7500 תאים לכל צלחת 35 מ&quot;מ עבור התרבות תאים ראשוניים. במקרים מסוימים, את הצפיפות הסופית ציפוי התא חייב להיות מותאם על ידי ביצוע ניסוי טיטרציה התא. עבור ניתוחים סטטיסטיים, המספר הכולל של מושבות שזוהו לאחר 21 ימים של תרבות צריכה להיות בטווח של לפחות 50-150 מושבות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדיום המכיל את התאים מעורבת בעדינות ולאחר מכן 1.3 מ&quot;ל של תמיסת קולגן קר מועבר ההשעיה התא ומעורבים היטב על ידי pipetting עדין כדי למנוע החדרת כל הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הוא לוותר מעורבת למרכז של כל מנה תרבות 35mm (~ 1.5 mL / תבשיל) וכן את הכלים הם היטה בעדינות בתנועות מעגליות לתת לתערובת להתפשט באופן שווה על פני השטח של המנה. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל 35 מ&quot;מ תרבות מנות ממוקמות לתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ. המכסה של מאכל חדש 35 מ&quot;מ הוא להסיר את המנה לפתוח ממוקמת גם את צלחת פטרי 100 מ&quot;מ אותו. מים סטריליים מתווסף צלחת זה 35 מ&quot;מ פתוח כדי לשמור על לחות אופטימלית במהלך תקופת הדגירה. צלחות המבדק סקוור (245 מ&quot;מ) משמשים כאשר לשכפל עוד 35 מנות מ&quot;מ הוקמו. שוב, כולל 2 או 3 מנות פתוח 35 מ&quot;מ המכיל מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלוחות מועברים להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו 95% לחות. נקרש קולגן על ידי הגדלת הטמפרטורה היווצרות קריש תתרחש בתוך כשעה. תרבויות לא צריך להיות מופרע בתקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בתרבית מודגרת במשך 21 ימים (הבדלים בגודל המושבה ניתן להבחין בבירור לאחר 21 ימים). </li></ol> 4. הכנת בינוני רענון והאכלת תרבות: כמו N-CFCA תרבויות מודגרת לתקופה ממושכת של זמן (21 ימים), תרבויות צריך להיות מוזן עם NeuroCult המלא הולם בינוני חידוש מוכן טרי כדלקמן: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.5 מ&quot;ל של מדיום NSC NeuroCult בסל הוא מעורבב עם 0.5 מ &#39;L של NeuroCult תוספי NSC הפצת נשק ולאחר מכן את גורמי גדילה הוא הוסיף: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 μL של 10μg/mL EGF (לתת הריכוז הסופי של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​EGF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 μL של 10μg/mL ב-FGF (לתת הריכוז הסופי של 0.25μg/mL ב-FGF) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 μL של הפרין 0.2%, נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 μL של NeuroCult בינונית המתאימה להשלים רענון (עבור תאים עובריים או מבוגר) יתווסף למרכז של כל מנה Assay NCFC פעם 7 ימים במהלך הדגירה Assay כולו NCFC תרבות (21 ימים). </li></ul> 5. ניקוד N-CFC המושבות Assay נגזר חישוב תדירות NSCs בתום לב ועל ובתאים עצבית: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 כל תרבות צלחת מ&quot;מ מונח על צלחת הבקיע gridded עם גודל רשת של 2.0 מ&quot;מ x 2.0 מ&quot;מ ואז הן המנות מונחות על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צריכת חשמל נמוכה (2.5x - 5X) המטרה העדשה, כל מנה נסרק המושבות הם הבקיע מבוסס על הגדלים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות מסווגים לשתי קטגוריות עיקריות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פחות מ 2 מ&quot;מ קוטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ≥ 2 מ&quot;מ קוטר </li></ol></li></ul> 6. נציג תוצאות: כמו assay neurosphere, תאים מצופה ב assay N-CFC להתחיל להתרבות ולגרום מושבות קטנות של תאים בתוך 3 - 7 ימים לאחר ציפוי (איור 1). בעוד שבועיים, מושבות בגדלים שונים ניתן להבחין. בעוד מרבית מושבות נוטים להפסיק לגדול לאחר 14 ימים, כמה מושבות להמשיך להגדיל את שטחו. ביום 21, מושבות ניתן לסווג לאחת מארבע קטגוריות: 1) פחות מ -0.5 מ&quot;מ קוטר, 2) 0.5-1 מ&quot;מ קוטר, 3) 1-2 מ&quot;מ קוטר 4) ≥ 2 מ&quot;מ בקוטר. למעשה, מושבות קטן יותר מאשר קוטר 2 מ&quot;מ מכונים אבי נגזרת (איור 2) ומושבות ≥ 2 מ&quot;מ בקוטר מכונים המל&quot;ל נגזרת (איור 3). מספר מושבות ≥ 2 מ&quot;מ בקוטר לכל התאים הכולל מצופה, מייצג את התדירות של התאים בפועל בתום לב גזע עצביים עם התחדשות עצמית לטווח ארוך ורב פוטנציאל היכולות. Neurosphere הכולל הקמת תדר באוכלוסייה תא מסוים אחרי יום 7-8 בניסוי NSA במקביל הוערך להיות דומה המושבה הכולל הקמת תדר של האוכלוסייה באותו התא לאחר 21 ימים בניסוי N-CFCA. N-CFCA לעומת זאת, מספק תנאי מתירני יותר כמו כל תא יכול להראות פוטנציאל שגשוג המלא. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> 2 משכפל </td><td> 3 משכפל </td><td> 4 משכפל </td></tr><tr><td> NeuroCult NCFC סרום ללא בינוני ללא ציטוקינים </td><td> 1700 </td><td> 2550 </td><td> 3400 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC הפצת תוספי </td><td> 330 </td><td> 495 </td><td> 660 </td></tr><tr><td> EGF (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 6.6 </td><td> 9.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> bFGF (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), רק תאים בוגרים </td><td> 3.3 </td><td> 4.95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> הפתרון הפרין (0.2%), רק תאים בוגרים </td><td> 3.3 </td><td> 4.95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (1:100) </td><td> 32 </td><td> 48 </td><td> 64 </td></tr><tr><td> תאים ב: 2.2 x 10 5 תאים בתרבית / mL או 6.5 x 10 5 תאים ראשוניים / mL </td><td> 25 </td><td> 37.5 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> קולגן פתרון </td><td> 1300 </td><td> 1950 </td><td> 2600 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. רכיבים של התרבות N-CFC להשלים assay. <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מושבות נציג בתרבות N-CFCA אחד E14 NSCs מעבר העכבר 7 ימים לאחר ציפוי. מושבות עשוי להציג מורפולוגיה גודל שונים. הגדלה מקורי; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מושבות אבי נציג נגזר בגדלים שונים בתרבות N-CFCA בקטע אחד של E14 NSCs עכבר 21 ימים לאחר ציפוי. כפי שניתן לראות, מושבות יש מורפולוגיה שונה אבל כל 2 מ&quot;מ פחות בגודל. הגדלה מקורי; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Bona נציג תא גזע בתום נגזר המושבה בתרבות N-CFCA את הקטע של E14 NSCs עכבר 21 ימים לאחר ציפוי. תא גזע שמקורם מושבות עשוי להציג מורפולוגיה שונה (ראהאת הוידאו) אך כולם ≥ 2 מ&quot;מ בקוטר. הגדלה מקורי; 4x

<ol>
	<li>Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay.">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li><li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li><li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays.">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li></ol>

אחד מחברי, שרון א &#39;לואיס, המזוהה עם StemCell Technologies Inc, יצרנית של כמה חומרים כימיים המשמשים במחקר זה.

למרות assay neurosphere 3,1,2 היא השיטה הנפוצה ביותר לבודד להרחיב בתאי גזע עצביים ממגוון רחב של מקורות כמו רקמת מערכת העצבים המרכזית מבוגרים עובריים, לא ניתן למדוד במדויק את תדירות NSC באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר (גזע אבות) כאשר אין מערכת יחסים 12:59 בין מספר neurospheres ומספר בתום בתאי גזע בתום 4. כדי לענות על מגבלה זו, NSA המקורי הותאם כדי לאפשר את גזע עצביים ואת אבות לגדול יכולת התפשטות המלא שלהם במשך שלושה שבועות 5-7. בניגוד NSA נוזלי, ב N-CFCA המושבות הם למעשה נגזרת clonally, כמו מטריקס חצי מוצק קולגן ומונע הגירה של תאים בודדים מצופה צבירה של המושבות. לקבלת תוצאות עקביות עם assay זה אנו ממליצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא השעיה תא יחיד ההשעיה התא המקורי. Pass ההשעיה תא בודד שלך דרך פילטר של 40 מיקרומטר בגודל רשת כדי להסיר אי - ניתק גושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הפתרון קולגן על הקרח או את המקרר 4 מעלות צלזיוס. קולגן הוא הפריט האחרון שיש להוסיף לתערובת של השעיה התא כפי שהוא נקרש על ידי הגדלת הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשכח להאכיל את התרבות בכל שבוע. הוספת בינוני חידוש המכיל גורם הגדילה (ים) פעם 7 ימים יאפשר התאים ממשיכים להתרבות במשך תקופה תרבות המורחבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות הסופי ציפוי תא מוטבו עבור תאים שמקורם או תאים עצביים ראשוני או תרבותי, כך שהמספר הכולל של מושבות זוהה לאחר 21 ימים של התרבות ב-NCFC נמצא בטווח של לפחות 50-200 מושבות. מגוון זה מאפשר איתור של הנדיר NSC מושבות נגזר&gt; 2mm בקוטר בדגימות תוך מתן בכמות מספקת של מושבות עבור ניתוחים סטטיסטיים. בהתאם למקור תא ההתחלה, משמעותית פחות (&lt;50) וכן מספרים גבוהים יותר של מושבות (&gt; 250) מתקבלים לפעמים. מושבות מעט מדי תגרום המושבות&gt; 2mm בקוטר להיות מתחת לרמות זיהוי, ואילו מושבות רבות מדי תגרום anddepletion הצפיפות של המדיום מרכיבי הצמיחה וכתוצאה מכך ספירת המושבה מדויק. לכן צפיפות ציפוי התא צריך להיות בהתאם (כלומר להגדיל או להקטין את המספר הכולל של תאים מצופה) </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td>
<td>Medium supplement</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NCFC medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.05% 	trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soybean trypsin inhibitor </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer </td>
<td>Sieve</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>136196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T80 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>178905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen</td>
<td>Reagent </td>
<td>STEMCELL</td>
<td>04902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>2028-EG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>b-FGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>3139-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>Growth factor</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>Reconstituted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm culture dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells

Assay neurosphere (NSA) הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר בשימוש על מנת לבודד, להתרחב גם לחשב את תדירות בתאי גזע עצביים (NSCs). יתר על כן, מערכת זו סרום ללא תרבות יש גם המועסקים להרחיב בתאי גזע לקבוע תדר שלהם מתוך מגוון של גידולים רקמות נורמליות. הוכח לאחרונה כי מערכת יחסים אחד על אחד אינו קיים בין היווצרות NSCs neurosphere. הדבר מצביע על כך NSA כמו המוחל כעת, מגזים בהערכת התדירות של NSCs באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר מבודד מהמוח שניהם יונקים עובריים מבוגרים. סרט הווידאו הזה מדגים למעשה קולגן הרומן מבוסס מוצקים למחצה assay, העצבית, המושבה להרכיב assay תא (N-CFCA), אשר יש לו את היכולת להבחין נובעת ובתאים מבוסס על הפוטנציאל שלהם לטווח ארוך שגשוג, ובכך מספק שיטה למנות את תדירות המל&quot;ל. בשנות ה N-CFCA, מושבות ≥ 2 מ&quot;מ קוטר נגזרות תאים העונים על כל הקריטריונים תפקודית של המועצה לביטחון לאומי, ואילו מושבות &lt;2mm נגזרות אבות. ההליך N-CFCA ניתן להשתמש בתאים מוכנים ממקורות שונים כולל בוגרים הראשי בתרבית תאים במערכת העצבים המרכזית או עובריים בעכבר. כאן אנו משתמשים בתאי מכינים את הקטע neurospheres שנוצר מיום 14 עובריים במוח העכברים לבצע N-CFCA. תרבויות הם מתחדש עם התפשטות בינונית כל שבעה ימים במשך שלושה שבועות על מנת לאפשר את התאים מצופה להפגין פוטנציאל שגשוג מלא שלהם ולאחר מכן התדירות של אבי עצביים בתום בתאי גזע עצביים בתום מחושב בהתאמה על ידי ספירת מספר מושבות כי הם &lt;2mm ואלה הם ≥ 2mm התייחסות למספר תאים שהיו מצופה בתחילה.

Watch this Scientific Journal Video about Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells at JoVE.com

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

neural-colony-forming-cell-assay-an-assay-to-discriminate-bona-fide

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.0K Views.  University of Florida. זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

Video: Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.