אנו מכירים ג&#39;ולי Heward על עזרה בהכנת hNSCs, וLavaniya Thanabalasundaram לתמיכה הטכנית שלה עם culturing הלה וtransfection.

1. בידול HNSC על שלוש תרבות ממדי (3D) הערה: לבודד ולהפיק hNSCs, מרקמה אתית אושרה, שתוארה בפרסום קודם 2. אנא פעל על פי הנחיות האתיות ומוסדיות בעת ביצוע הליך זה. 1.1) 3D תרבות שימוש בצלחת 12 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקת aseptic לאורך כל ההליך. בארון בטיחות ביולוגי, פיגומים מחדש מימה על ידי הוספת 2 מיליליטר / גם של 70% אתנול הוכנו באמצעות מים להשקיה (WFIr). הימנע מלגעת בפיגומים על ידי מחלק אתנול 70% במורד הקיר של כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב אתנול 70% ולשטוף באופן מיידי את הפיגומים עם 2 מיליליטר / גם DMEM: F12 דקות 1. חזור על תהליך השטיפה פעמיים. בזהירות לשאוב DMEM: F12 לאחר השטיפה הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי מעיל על ידי הוספת 2 מיליליטר / היטב laminin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בDMEM: F12. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% זמזום CO 2חממת idified עבור מינימום של 2 שעות. את צלחת יש לשטוף עם DMEM החם: F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע כל פיגום עם כ -500,000 hNSCs בהיקף של 150 μl של GFS RMM +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5% כדי לאפשר לתאים להתיישב לפיגומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3.5 מיליליטר של RMM לכל טיפול גם לוקח לא כדי לסלק תאים מפיגומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך 7 ימים; להחליף בינוני RMM (3.5 מיליליטר / טוב) לאחר יום 1 (האכלה ראשונה) ושוב לאחר 2-3 ימים מההאכלה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים, להסיר בינוני ולתקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) עבור immunocytochemistry (ICC) או להוסיף 500 μl / טוב של מגיב תמוגה להפקת RNA כולל (צלחת חנות ב≤ -80 ° C או להמשיך לסך הפקת RNA) . </li></ol> 1.2) מדידת תולדה תהליך אקסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם PFA 4% קבועים hNSCs המובחן על פי פרוטוקול סטנדרטי ICC 20 β באמצעות3-טובולין נוגדן ראשוני זוהה עם נוגדנים משני מצומדות fluorochrome (TUBB3). גרעין תא Counterstain עם Hoechst (1 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות נציג של תאים מוכתמים β3 טובולין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; לשמור תמונות כמו TIFF או JPEG. מדד של תולדת תהליך האקסון באמצעות כלי מדידת תוכנה (פלוס למשל-Pro תמונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה, אפשרות מדידות בחרו בסרגל הכלים, ובחר תכונת עקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את העקבות, בחר את נקודת ההתחלה בתולדת האקסון על ידי לחיצה על לחצן העכבר. צייר קו לאורך כל אורכו של האקסון תולדה; לחץ על זכות לסיים כל עקבות. חזור למדוד כל outgrowthswith האקסון בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה מדידות כפיקסלים או מיקרומטר (תלוי ועומד כיול להגדיר). מדידות אורך יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים לדוגמא ניתוח השוואתי וסטטיסטי. </li></ol> 2. ביטוי מירנה שימוש בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים מערך מירנה PCR ממוקד 2.1) סך הפקת RNA מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חילוץ מירנה על פיגומים ודגימות 2D גדל (הבדיל ושליטה עברו התמיינות, hNSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי הפשרה, הוכנסו בצלחת גם 12, אם נדרשו. לשלב תוכן תמוגה מגיב (500 μl) של 2 בארות באותו הצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, נפח סופי של 1 מיליליטר של מגיב תמוגה. תשמור על עצמך לעזוב את הפיגום בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות שנאספו בעבר כיבשה תא pelleted 2D גדל (תרבויות hNSC 2D מובחנות ושליטה עברו התמיינות) להוסיף 1 מיליליטר של מגיב תמוגה ולהעביר תכנים לתוך 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize כל דגימת בדיקה באמצעות מזרק 1 מיליליטר ומחט מד קצר 20 עד 25. להעביר את lysate דרך המחט באמצעות מזרק 1 מיליליטר עד 5 פעמים עד lysate הומוגנית מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של כלורופורם על צינור אחד Eppendorf וכובע בצורה מאובטחת. צינורות היפוך ומערבולתלערבב תוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל homogenate המכיל 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge במשך 15 דקות ב≥12,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השלב המימי העליון של כל דגימה (להימנע מהעברה כל נוזל צבעוני הביניים, ורוד) לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי המכיל 750 μl של 100% אתנול. מערבבים היטב על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עד 700 μl של כל מדגם בדיקה, כוללים כל משקע, לעמודת מיני בצינור איסוף 2 מיליליטר. סגור את המכסה וצנטריפוגות ב≥8,000 XG למשך כ -30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך. חזור על שלב זה באמצעות שאר המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תקציר DNA במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף RWT חיץ 700 μl לעמודה ו צנטריפוגות מיני לכ 30 שניות ב≥8,000 x ז. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור מיני-ידי הוספת הרשתית חיץ 500 μl וצנטריפוגה למשך כ -30 שניות ב≥8,000 x ז. מחק את הזרימה דרך. wash.Ce חזורntrifuge ב≥12,000 XG דקות 1 לייבש את הקרום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute RNA הכולל בצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר על ידי הוספת 40 μl מים RNase ללא לעמודת המיני וצנטריפוגה 1 דקות ב≥8,000 x ז. למדוד כולל ריכוז RNA בעזרת ספקטרופוטומטר מתאים. </li></ol> 2.2) מירנה cDNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת מאסטר ההפוך-שעתוק. כל דגימה דורשת 4 μl של חיץ 5x miScript HiSpec, 2 μl של תמהיל 10x nucleics, 2 μl miScript להפוך תערובת transcriptase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl Aliquot 8 של תערובת השני בצינור PCR, להוסיף נפח הנדרש של רנ&quot;א הכל (250 ng), ולהוסיף מים RNase ללא לנפח סופי של 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות למשך 5 דקות C.Incubate על 95 מעלות צלזיוס כדי להשבית miScript ההפוך transcriptase Mix. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מים RNase ללא μl לתגובת כל 20 μl הפוך שעתוק, חנות ב -20 ° C, או להמשיך עם אמת-tiשלי PCR באופן מיידי. </li></ol> 2.3) בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים ממוקדים מערך מירנה PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת רכיבי PCR בצינור 15 מיליליטר על ידי הוספת 1,375 μl של תערובת אמן הירוק 2x SYBR, 100 μl הכנת מירנה cDNA, 275 μl של 10x miScript יוניברסל פריימר, ו 1000 μl מים RNase ללא (סה&quot;כ נפח 2,750 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת רכיבי PCR על מאגר טעינת PCR. מוציא בזהירות את מערך הצלחת PCR 96-היטב מהשקית האטום שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תערובת רכיבי PCR 25 μl היטב בכל מערך ה- PCR באמצעות pipettor 8 ערוצים, או pipettor 12 ערוצים באמצעות רק 8 טיפים. לשנות טיפים pipet הבאים כל שלב pipetting, כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחת עם סרט דבק אופטי, ו צנטריפוגות 1 דקות XG ב 1000 בטמפרטורת חדר (15-25 ° C) כדי להסיר בועות. ראייה לבדוק את הצלחת מתחת כדי להבטיח שאין בועות נמצאות בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מערך ה- PCR 96 צלחת גם באת Cycler בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית Cycler בזמן אמת בהתאם: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו -45 מחזורים במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ודקות 1 ב 60 ° C להגדיר (איסוף נתוני הקרינה) בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את ערכי ה- CT לכל הבארות לגיליון אלקטרוני Excel ריק לשימוש עם מערך PCR ניתוח נתונים תבנית Excel ותוכנה מבוסס אינטרנט. הערה: תוכנה זמינה <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">בwww.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php.</a> </li></ol> 3. חישובית ניתוח לחיזוי יעד מירנה ותיקוף היעד mRNAs על ידי Reporter פלסמיד Transfection וDdual בלוציפראז Assay. 3.1) חישובית ניתוח לחיזוי מירנה יעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיון PicTar <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">(http://pictar.mdc-berlin.de/)</a> 21, אלגוריתם זמין באינטרנט לזיהוי miRNA למקד mRNAs תחזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;לחץ כאן לקבלת תחזית PicTar על בעלי חוליות&quot;. דף חדש ייפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדף החדש, ממשק האינטרנט PicTar, לבחור מינים בתפריט הנפתח ולהכניס מירנה עניין בתיבת מירנה ID. לחץ על חיפוש עבור מטרות של מירנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב רשימה של mRNAs היעד מדורג על ידי ציון aPicTar. הערה: PicTar מחשב ציון המשקף את הסבירות שUTR נתון יהיה ממוקד על ידי מירנה נבחרה, ומבוסס על השלמת זרע, תרמודינמיקה וחיזוי קומבינטורית למטרות משותפות בקבוצות של miRNAs הביע שיתוף 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה לאחזר רשימה של mRNAs היעד באמצעות DIANA-LAB <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)</a> 23, וTargetScan <a href="http://www.targetscan.org/">(http://www.targetscan.org/)</a> 24, על קו חלופי זמין אלגוריתמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל טבלה השוואתית של מטרiRNAs מבוסס על דירוג שהושג באמצעות כלי תוכנה שונים. PicTar מדרג על ידי ציון, DianaLab ידי דיוק (המבוסס על יחס אות לרעש וציון דיוק להערכת המשמעות של התוצאות הצפויות), וTargetScan ידי PCT המצרפי (המבוסס על השלמת זרע, אנרגיה חופשיה של מחייב, שימור על מינים שונים), ראו טבלה 1. </li></ol> 3.2) תיקוף היעד mRNAs על ידי Reporter פלסמיד Transfection וDual בלוציפראז Assay. הערה: 3 כתבי לוציפראז UTR &#39;לאימות של יעד mRNA כבר תיארה בעבר 25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הלה זרע בצפיפות של 10 5 תאים / גם בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאי הלה 24 שעות, שיתוף transfect עם 1.5 μl של מגיב transfection ושל NR4A3 3 פלסמיד UTR &#39;UTRor SOX5 3&#39; או 100 ng, כמו גם 20 ננומטר מחקה מירנה (HSA-miR-96-5p לSOX5 3217; UTR, וHSA-miR-7-5p, וHSA-miR-17-5p לNR4A3 3 &#39;UTR בהתאמה) בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות שליטת Co-transfect עם NR4A3 3 UTRplasmid &#39;UTRor SOX5 3&#39; וsiRNAs שליטה שלילית fluorochrome שכותרת. Transfection של בארות שליטה עם siRNAs שליטה השלילי fluorochrome שכותרתו מאפשר הערכה של יעילות transfection ומהווה סגוליות bind מירנה 3&#39;UTR לחקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של פעילויות בלוציפראז הכפולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הפעילות בלוציפראז Firefly וRenilla לאחר transfection 24 שעות. הסר בינוני צמיחת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד אני על ידי הוספת 50 μl של מצע אני לתוך 10 מיליליטר של הפתרון אני; מערבב היטב. להוסיף 300 μl של פתרון עובד אני לכל 24 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התוכן של כל 24 גם לתוך 3 בארות של צלחת לבנה 96, 100 μl כל אחד. חכה 10 דקות ולמדוד לוציפראז Firefly בסט luminometer לרכישת הארה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן solut עובדהיון השני על ידי הוספת 50 μl של המצע השני ל -10 מיליליטר של התמיסה II; מערבב היטב. הוספה של פתרון עובד לי 100 μl היטב לתוך כל אחד 96 כבר מכיל של I. פתרון עובד 100 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 10 דקות ולמדוד לוציפראז Renilla בסט luminometer לרכישת הארה. לחשב את היחס של הארה מלוציפראז Firefly ללוציפראז Renilla. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration.">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li><li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke.">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li><li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation.">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li><li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke.">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li><li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion.">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li><li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+repair:+cell+therapy+in+stroke.">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li><li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+feel+the+difference.">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li><li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells.">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).</li><li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype.">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li><li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alvetex(R):+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture.">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture:+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity.">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function.">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li><li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures.">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data.">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels.">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).</li><li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+seed+pairing,+often+flanked+by+adenosines,+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets.">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li><li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3'UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells.">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance,+pyramidal+cell+survival,+and+seizure+susceptibility.">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li><li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway.">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

כל הכותבים הם עובדים, מלאי ו / או מחזיקי אופציות ברה-נוירון בע&quot;מ או החברה האם שלה. מחקר זה נתמך על ידי רה-נוירון (RENE.L).

הפיתוח חדש במבחני חוץ גופית על מנת להעריך ולשפר את ההתמיינות של תאי גזע תמיד הציג אתגר לחקירת הפונקציות שלהם והיכולות טיפוליות. לטווח ארוך ויציב של קובץ מצורף hNSCs, הנדרש לפיתוח של 3D חזק בassay בידול מבחנה, טופל על ידי בדיקת מספר מצעי 3D עם מאפיינים שונים בטווח של חומרים ומבנים. כחלק מפיתוח assay אנחנו גם הערכנו ריכוז זריעת תאים אופטימלי וזיהינו את הדרישה לפיגומים להיות מצופים laminin. למרות hNSCs שלנו באופן ספונטני יכול להבדיל על 4-OHT והסרת גורם גדילה, יישום מערכת תרבות 3D הראו שיפור משמעותי ביכולת הבידול שלהם כפי שהיא נמדדים על ידי תולדת תהליך האקסון בהשוואה לhNSCs 2D המובחנת הסטנדרטי. כדי לחקור את ההשפעה של differe 3D המושרהntiation על ביטוי hNSC מירנה השתמשנו מערך PCR. לעומת microarray שבב סטנדרטי מערך PCR מציע את היתרונות של כימות ואימות ישירות של מירנה עניין. למרות שמערך ה- PCR מוגבל בטווח של מספר הכולל של מירנה בכל מערך, למשל כאן פחות מ -96, זה יכול להיות מותאם לכולל במיוחד miRNAs של עניין, במקרה שלנו שדווח בעבר בפיתוח תאי גזע. הביטוי של miRNAs מסלול ממוקד היה צדודית בhNSCs המובחנת 3D ו 2D לעומת hNSCs מובחן. MiRNAs באופן משמעותי ביותר למטה מוסדר נבחרו ונותח להעריך mRNAs היעד המשוער שלהם במטרה לקבוע את הפונקציונליות שלהם ופרשנות ביולוגית באמצעות אלגוריתמים זמינים באינטרנט (Lab דיאנה, PicTar, וTargetScans). מירנה אחד יכולה לזהות מאות יעדים ומסיבה זו אנו תוקף אינטראקציות מירנה עם 3 &#39;UTR mRNAsthat עשוי להיות מועמדים מתאימים בהרגולציה xonal. NR4A3, יעד של HSA-miR-7, וmiR-17 משפחתי, הוא חבר של קולטנים הגרעיניים משפחת NR4A ש, תלוי ברמת ביטוי שלהם, מעורבים בהבחנה, ההישרדות, אפופטוזיס והרגולציה של האקסון בהיפוקמפוס הדרכת 26. באופן דומה SOX5, יעד של HSA-miR-96, הוא דיווח לשלוט התקדמות מחזור התא בתאי אב עצבי 27 אורך האקסון 28, הגירה, בידול פוסט-נודד, ותחזיות של נוירונים 29. SOX5 וNR4A3 שני זוהו כmRNA יעד ישיר של HSA-miR-96, וHSA-miR-7 ו -17 בהתאמה על ידי מבחני כתב בלוציפראז כפולים. לוציפראז הכפול (Firefly וRenilla) מסתמך על שני גני כתב שונים באותה פלסמיד ומציע מערכת משופרת המאפשרת נורמליזציה לאפקטים הנגרמים על ידי transfection לא טוב ואפקטים רעילים לתאים בהשוואה למערכת פלסמיד בלוציפראז יחידה. כחלק מפיתוח assay שלנו אנחנו גם מותאמים conditi transfection שלנותוספות על מנת לקבל יעילות גבוהה. Protocolsdescribed במסמך זה עשוי להיות מנוצל כדי לייעל עוד יותר ולאפיין בידול במבחנה hNSC אשר עשוי beimplemented פרוטוקולי intransplantation ללימודי קדם-קליניים ויישומים קליניים בעתיד.

מחקר בתאי גזע ממלא תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית, שגם משתרעת על פני הדיסציפלינות של הנדסת רקמות, ביולוגיה של תא התפתחותיים, הרפוי סלולארי, ריפוי גנטי, וביו-חומרים (פיגומים ומטריצות). תאי גזע הם חשובים בשני תיקון רקמות developmentand האיבר; ההבנה כיצד תאי גזע לעבוד היא מרכזית לפיתוח טיפולי 1 תאי גזע חדשים המבוססים. CTX0E03 הוא תאי גזע עצביים שהונצחו על-תנאי אנושיים קו משובט, (hNSC) 2 מבודדים מהשליש הראשון אדם קליפה עוברית. CTX0E03 הגדיר מאפייני איכות שהם חיוניים לבנקאות סלולארי קלינית תחת תרגול טוב ייצור (GMP) 3. HNSCs באופן ספונטני יכול להתמיין לתאי עצב, גליה, וoligodendrocytes והוכח לשפר גירעונות נוירולוגיות כאשר הושתל במודל מכרסם של 2,4,5 איסכמיה מוקד. CTX0E03 hNSCs כרגע בניסויים קליניים לdisabil שבץity (NCT01151124 6 וNCT02117635, Clinicaltrials.gov). יש לי miRNAs 22 נוקלאוטידים ממוצע באורך ומוכח מולקולות רגולציה 7, הם לא מקודדים חלבונים, אלא להיקשר 3 אזור ראש מתורגם (3&#39;UTR) של mRNAs, המסדירים את יציבותם ותרגום לחלבונים. MiRNAs מדווחים להשתתף ברגולציה של מספר התהליכים תאיים, כוללים פיתוח, שגשוג, והבחנה 8. כמה miRNAs היה מעורב בויסות הגורל והמפרט של תאי גזע עצביים 9. בשני ממדים (2D) סביבת תרבות סטנדרטית מורכבות סביבת in vivo לא התאימו, וכתוצאה מכך האינדוקציה והרגולציה של בידול hNSC אינה אופטימלית. בvivo, תאים מוקפים במייקרו-סביבה תלת ממדים (3D) שחובר על ידי אחר תאים וligands תאי, כולל רביםסוגי collagens, laminin, וחלבונים אחרים מטריצה ​​(חוץ-תאי, ECM). מחקרים קודמים דיווחו כי הטופוגרפיה האדריכלית של החומרים מחקת ECMS ופנוטיפ תא השפעת הגיאומטריה שלהם וגורל 10-15. מספר פיגומי 3D הזמינים מסחרי זמין; אנו משמשים פיגום קלקר נקבובי ביותר מהונדס עם ארכיטקטורה מוגדרת היטב ואחידה לקרום עבה 200 מיקרומטר המספק 3D שטח שאליו תאים יכולים לפלוש ולהבדיל 16-18. מבחני בידול במסמך זה 2D and 3D משמשים כדי להעריך תולדת axonprocess. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לפרופיל ביטוי מירנה של קו hNSC הכיתה קליני להמשיך לחקור תופעות מירנה על בידולה. השיטות לכאן מאוירות המבוססות על אלה שתוארו במקור ב -19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

תאי גזע עצביים (NSCs) מסוגלים התחדשות עצמית ובידול לתוך הנוירונים, האסטרוציטים וoligodendrocytes תחת microenvironments המקומית הספציפית. כאן, אנו מציגים סדרה של שיטות המשמשות לשלושה בידול ממדי (3D) וניתוח מירנה של קו משובט תאי גזע עצביים אנושיים (hNSC), כיום בניסויים קליניים עבור נכות שבץ (NCT01151124 וNCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs נגזרו מהשליש הראשון אדם קליפה עוברית אושרה אתית ותנאים הונצח באמצעות שילוב retroviral של עותק יחיד של c-mycER TAM לבנות. אנו מתארים כיצד למדוד תולדת תהליך האקסון של hNSCs המובחן על פיגומים וכיצד לכמת שינויים הקשורים בביטוי מירנה באמצעות מערך PCR 3D. יתר על כן אנו מדגימים אנליזה חישובית במטרה בחירת מירנה מטרות המשוערות. SOX5 וNR4A3 זוהו כיעד משוער מתאים מירנה של נבחר באופן משמעותי כלפי מטה-להסדירmiRNAs ד בhNSC המובחן. אימות יעד מירנה בוצעה על SOX5 ו3&#39;UTRs NR4A3 ידי transfection פלסמיד הכתב הכפול וassay בלוציפראז הכפול.

באיור 1 היא דמיינה את החקירה וכימות של בידול hNSC על פיגומי 3D לעומת תרבויות משטח שטוחות מסורתיות (2D) וexpressedas מדידות תולדת תהליך האקסון. באיור 2 היא representedthe זרימת עבודה ואת התוצאות לכימות מירנה שימוש בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים התמקדו מערך מירנה PCR לחקור ביטוי ההפרש של miRNAs בhNSCs המובחן 2D and 3D לעומת שליטה מובחנת. ניתוח השוואתי בין מירנה הבאה hNSCs המובחן ובלתי-המובחן, ואנליזה חישובית לחיזוי היעד, SOX5 וNR4A3 (NOR1) זוהו כmRNAs יעד משוער. ללמוד אינטראקציה הישירה בין miRNAs והאתר המשוער שלהם על mRNA 3&#39;UTR השתמשנו 2 פלסמידים זמינים מסחרי המכילים גם SOX5 או רצף NR4A3 3&#39;UTR הוכנסו במורד הזרם של גן הכתב בלוציפראז גחלילית,<html> nd המכיל באותו הגן בלוציפראז renilla פלסמיד לנורמליזציה. תוצאות הנציג של 3 פעילות לוציפראז &#39;UTR למטה ויסות מוצגות באיור 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> איור 1:. בידול של hNSCs על פיגומי 3D, ומדידה של תולדת תהליך es האקסון () בעקבות צביעת ICC סטנדרטית לβ3 טובולין (ירוק) וגרעינים counterstained עם Hoechst (כחול) microphotographs נציג נרכשו והמדידה של תהליכי האקסון היו בוצע בסיוע תוכנת ניתוח תמונה. (ב) תרשימים דיווח המדידה של תולדת תהליך האקסון שבוצעה בhNSCs המובחן 2D and 3D עבור 1 (1W) או 3 שבועות (3W).com / קבצים / ftp_upload / 52,410 / &quot;target =&quot; 52410fig1highres.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> איור 2:. עבודה סכמטי של פרופיל מירנה בhNSCs המובחן RNA סה&quot;כ, כולל miRNAs, הופק משני hNSCs המובחן על פיגומי 3D ותרבויות 2D סטנדרטיים, או שליטה מובחנת. 250 ננוגרם של רנ&quot;א הכל היה עם שיטה המאפשרת את ההמרה סלקטיבית של miRNAs הבוגר לcDNA המתאים לכימות מירנה עם התמיינות תאים אנושית ופיתוח מערך miScript מירנה PCR-עיבד רטרו. גיאו-הממוצע של SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, וRNU6-2 שימש לניתוח נתונים המבוסס על שיטת 2 -ΔΔct. שינויים משמעותיים הוגדרו כ+/- 1.5 לקפל למעלה ולמטה רגולציה לstaבמידת tistically משמעותית. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה מבוססת אינטרנט זמינה בתוצאות באות לידי ביטוי כclustergram. שונה מאיור 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> איור 3: אימות של יעד מירנה חזתה mRNA באמצעות assay דו&quot;ח לוציפראז כפול. תרשים נציג של פלסמיד כתב בלוציפראז כפול משמש ככלי כדי לאמת את רצף 3&#39;UTR כמטרה ישירה של מירנה (). (ב) מיקרוסקופ נציג מראה יעילות transfection. (C) &#160; אותות, הביעו כפעילות לוציפראז היחסית, בין 3 &amp; # אדם39; גני כתבי UTR ofSOX5 וNR4A3 הופלו באופן משמעותי כלפי מטה בנוכחות HSA-miR-96, וHSA-miR-7 ו -17 מחקה מירנה בהתאמה. שונה מאיור 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> מירנה </td><td> גן המטרה </td><td> אתרי יעד / גנים שנמצאו </td><td> Precision </td><td> ציון </td><td> המצרפי P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> טבלת 1: רשימה של mRNAs חיזוי יעד מירנה. שולחן נציג של miRNAs, למקד את הגנים חזוי, וניתוח אלגוריתמים (לחזותיון / ציון / כולל הניתן באמצעות המעבדה דיאנה, PicTar, וTargetScan בהתאמה). שונה מטבלה 3 19.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K Views.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Video: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...