המימון לפרויקט זה מתפרסם על ידי קרן קלייטון למחקר קרן מחקר רשתית.

1. הכנת tumorspheres רטינובלסטומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג הגידול מדגם רטינובלסטומה תחת פרוטוקול שאושר-IRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי מוגדר תא גזע התקשורת (Neurobasal-מדיה, 1X B-27 תוסף ויטמין A מינוס, 1X שאינם חיוניים פתרון חומצת אמינו, 1X L-גלוטמין, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה מכנית disaggregate רקמת הגידול עם אזמל בטכניקה צולבות חיתוך, סטרילי רקמה תרבות שטופלו 6-גם צלחת. מיד להוסיף 100 μL של התקשורת תא מוגדר גזע לרקמה בעדינות להפיץ את רקמת טחון באמצעות אזמל. הוסף 5 מ&quot;ל של התקשורת תא גזע מוגדרים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתוך חממה humidified ולבדוק מדי יום. Tumorspheres כמה צריך לנבוע רקמת הגידול שיבשו כמעט מיד, עם מספר גדל והולך במשך 2-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועי, tumorspheres צנטריפוגות ב 300xg במשך 5 דקות, resuspend ב המוכן טרי מדיה תא מוגדר גזע, pipet למעלה ולמטה 10 פעמים לשבש גדול, תחומי נמקי מרכזי ולאפשר חדשים, תחומים בריא הטופס. </li></ol> 2. הכנת תאים סרטניים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הזרקת tumorspheres תרבותי, תחומי pipet בעדינות לתוך צינורית 15 מ&quot;ל קונית. Pipet בעדינות מעלה ומטה עם pipet סרולוגיות 10-15 פעמים לשבש את התחומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים להיות מוזרק באמצעות hemacytometer ו aliquot לפחות 50,000 תאים לכל הזרקה לתוך צינור חדש. היכונו כמו זריקות רבות ככל האפשר על פי מספר התאים הזמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 300xg במשך 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend ב 5 מ&quot;ל PBS. חזור צנטריפוגה והשאיפה ו resuspend ב 10 PBS μL לכל זריקה. </li></ol> 3. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק אינסולין, לנהל זריקה intraperitoneal של קוקטייל הרדמה מכרסם (קטמין 37.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל, xylazine 1.92 מ&quot;ג / מ&quot;ל, acepromazine 0.38 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בשעה μL 1 גרם לכל משקל גוף (gbw). המתן 5 דקות החיה להיות מסומם. בדוק דופק והמקום בעלי חיים על משטח לוהט. שמור על בעלי חיים על משטח לוהט בכל עת עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרגעה, לנהל ירידה של 1 proparacaine HCl בעין ימין. החלף חיה על כרית מחוממת לחכות 1 דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול 1 טיפה של phenylephrine HCl בעין ימין. החלף את חיה על כרית מחוממת לחכות 5 דקות. אם התרחבות של התלמיד לא קרה, מחדש לנהל 1 טיפה לחכות עוד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב אחר סימני חיים של תנועה, או מתעוות, אשר עשוי להתרחש בכל&gt; 30 הדקות שלאחר הרגעה. בשלב הסימנים הראשונים של התנועה, לנהל μL 1 / gbw של קטמין הידרוכלוריד (מדולל ל -10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) ומחכים 5 דקות. </li></ol> 4. הזרקה של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה הרדים מתחת למיקרוסקופ על צידו, עם עין ימין פונה כלפי מעלה ועם הראש נח על גזה מרוכז כדי להשיג רפלקס אדום בעין ימין הפונדוס (תלמיד צריך להיות מורחבים בשלב זה) כאשר נצפו מבעד למיקרוסקופ . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנכס את העולם ימינה ידי בעדינות לדחוף למטה בו זמנית עם שתי אצבעות על העפעפיים ולהחזיק בעמדה זו בהתמדה עד סוף ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית 30-מד מצורף מזרק Luer-מנעול, לחדור את העולם רוחבית דרך לחמית והלחמית סמוך גובלת באזור הקרנית של פלאנה Pars (איור 1), ורק דרך דמית העין לתוך חלל הזגוגית. הסר את המחט מן הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את מחט המילטון עם ספוגית אלכוהול. צייר את ההשעיה התא לתוך המזרק המילטון להכניס את המחט לתוך הפתח עד המחט היא דמיינו מבעד למיקרוסקופ מאחורי העדשה בתוך הזגוגית ליד הרשתית. בעזרת אדם נוסף, כשהוא אוחז את המחט בהתמדה במצב זה, לוחץ על המתג לאט. הסר את המחט. במידת הצורך, להשתמש צמר גפן על מנת לספוג את הנוזלים מן הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשחרר את הלחץ של העפעפיים כדי לסגור את העפעפיים העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול 1 טיפה של hypromellose לכל עין ולחזור חיה לרפד מחומם להתאוששות. </li></ol> 5. ניטור של עכברים שהוזרק והקציר של גידולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום, לבחון את העין מוזרק עבור leukocoria (לבן papillary רפלקס) ו / או התנפחות periocular כי בדרך כלל מתברר 2-4 שבועות לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגידול מזוהה, להרדים בעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם את העין ואת הגידול מכוסים על ידי העפעפיים, השתמש באזמל לעשות שני חתכים אורתוגונליים אל הסדק palpebral ולהרים את שולי העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לעשות חתך ההיקפי בבית לימבוס, להסיר את הקרנית ואת העדשה, בזהירות לנתח את עיקר מסת הגידול מן ברקמות אחרות באמצעות תינניותzers. מניחים את הגידול סטרילי RPMI-1640 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה לאט למשוך את העולם לפתוח מהשקע. כדי להבטיח את עצב הראייה המצורפת כך הפלישה הגידול ניתן דמיינו, למשוך את הגלובוס עד עצב חשוף ולהשתמש מספריים לחתוך את העצבים כמה שיותר זמן. מקום 10% פורמלין לעיבוד קבוע לבדיקה היסטולוגית. </li></ol> 6. נציג תוצאות: Tumorspheres רטינובלסטומה יתחילו להופיע מן הרקמה disaggregated כמעט מיד כאשר הם משוחררים מסת הגידול. בתוך 2-4 ימים, tumorspheres יותר יתחילו הטופס יגדל בגודל. הכדורים נוטים להיות קבועים התערוכה מוגדרים היטב, קרום משנית המקיפה את המצרף (איור 2). בעלי חיים בדרך כלל מתנות עם leukocoria בתוך 4 שבועות לאחר ההזרקה (איור 3 ב), ואחריו הגדלה של הגלובוס התנפחות של הרקמות הסובבות 5-8 שבועות לאחר ההזרקה כמו הגידול גדל (איור 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. חתך תרשים של העין העכבר הדגשת תכונות הפניה בפרוטוקול. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. התרבות של תאים רטינובלסטומה אדם במבחנה צילמו בבית) 4x, ו ב) הגדלה 10x אובייקטיבי. העיקרי רטינובלסטומה תאים סרטניים לייצר tumorspheres עם צורה spheroid רגיל הקרום החיצוני פריך. ברים סולם מייצגים) 500 מיקרומטר, ב) 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3 עין Rag2 -. / - עכבר מראה) תכונות רגיל, ב) leukocoria מעיד על מסת גידול חלל הזגוגית, ג) מסה הגידול גדול ממלא את העולם עם distension periocular קשור, דימום תוך עיני.

<ol>
	<li>Ch&#232;vez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma.">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li><li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors.">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li><li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors:+Dependence+on+Receptor+Expression.">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי מכללת ביילור לרפואה IACUC הוועדה.

הטכניקה המתוארת במסמך זה מאפשר רטינובלסטומה התפשטות גידולים בסביבה התוך עיני, intravitreal שלהם. טכניקת ההזרקה התוך עיני שימש בעבר ליצירת גידולים של רטינובלסטומה הנגזרות שורות תאים 1 וכן לספק וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי התוך עיני 2,3. טכניקה זו עכשיו נוצלו בהצלחה לייצר גידולי רטינובלסטומה אדם על ידי הזרקה ישירה של תאים מהגידול הראשוני של הזריקה tumorspheres כמו גם התפשטות של גידולים xenograft סדרתי. ראיות גלוי של היווצרות הגידול (בדרך כלל leukocoria) הוא בדרך כלל ציין הראשון בתוך 4 שבועות, לאחר דימום תוך עיני התנפחות של ו הגלובוס / או הרקמות הסובבות את המסלול לפתח בתוך 5-8 שבועות. מיעוט של עכברים שהוזרק לפגוע עין מוזרק, המוביל סגירתו של העפעפיים. במקרים אלה, התנפחות הוא הסימן היחיד של היווצרות הגידול. הקמת גידולים xenograft Murine לא הצליחה עם כל גידולי רטינובלסטומה האדם, אם כי התפשטות של גידולים xenograft הוקמה הוא מוצלח ביותר. תצפית זו מרמזת כי מאפיינים מסוימים של הגידול הראשוני, כגון הפולשנות ורמת בידול או כל גורם ידוע אחר, עשוי להיות השפעה על היכולת של גידולים אלה להתמיד בסביבה עינית Murine. כמות רקמת כי ניתן לרכוש מן הגידול רטינובלסטומה האדם הוא די קטן, ויש מגבלות משמעותיות על היכולת האנושית התרבות תאים במבחנה רטינובלסטומה כגון תוחלת חיים מוגבלת, אובדן היסטולוגיה גידולים מוצקים ושינויים פנוטיפ הסלולר. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה יחסית, כדי להפיץ את הגידול האנושי לבסס מודל Murine של המחלה האנושית. זה מאפשר עוד במבחנה ניסויים vivo של הביולוגיה של רטינובלסטומה והתחזוקה ארוך יותר מחוץ הגידול של המטופל.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Phenylephrine HCl 2.5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> עיניים פתרון </td></tr><tr><td> 30-ga מחט </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> רגיל שפוע </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל Luer-Lock מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc מזרק אינסולין </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> מטליות אלכוהול </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ובכן, פלייט רקמות תרבות שטופלו </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacaine HCl 0.5% </td><td> באטלר AHS </td><td> 017239 </td><td> עיניים פתרון </td></tr><tr><td> קטמין HCl 100mg/mL </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-μL המילטון מזרק </td><td> המילטון החברה </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-ga המילטון מחט </td><td> המילטון החברה </td><td> 7803-04 </td><td> אורך מותאם אישית - 0.5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-Media </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 בתוספת ויטמין A מינוס, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 Media </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Non-חיוני חומצה אמינו פתרון, 100x </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין, 100x </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td><td></td></tr><tr><td> פנויה # 11 איזמל </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> הרדמה מכרסמים Combo </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> In-בית מרקחת ניסוח (קטמין 37.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל, xylazine 1.92 מ&quot;ג / מ&quot;ל, acepromazine 0.38 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> רקומביננטי הגורם האנושי צמיחה עוריות (EGF) </td><td> STEMCELL טכנולוגיות </td><td> 02633 </td><td> מחדש ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון </td></tr><tr><td> רקומביננטי גדילה אנושי בסיסי פיברובלסטים פקטור (bFGF) </td><td> STEMCELL טכנולוגיות </td><td> 02634 </td><td> מחדש ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון </td></tr><tr><td> OMS-75 מבצע מיקרוסקופ </td><td> Topcon מערכות רפואיות </td><td> OMS-75 </td><td> מודל זה הופסק </td></tr><tr><td> 10% פורמלין </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

establishment and propagation of human retinoblastoma tumors in immune deficient mice

רטינובלסטומה culturing גידול תאים בתקשורת תא מוגדר גזע מעורר tumorspheres העיקרי ניתן לגדל ומתוחזק לזמן מוגבל בלבד. אלה tumorspheres תרבותי עשוי להפגין פנוטיפים הסלולר שונה במידה ניכרת בהשוואה הגידולים המקוריים. הפגנה כי תאים בתרבית יש את היכולת להרכיב גידולים חדשים חשוב לוודא כי הדגם תאים בתרבית הביולוגיה של הגידול המקורי. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצת גידולים רטינובלסטומה אדם in vivo באמצעות Rag2 - / - עכברים חסר החיסונית. Cultured tumorspheres רטינובלסטומה האדם של מעבר נמוך או התאים המתקבלים שנקטפו זה עתה גידולים רטינובלסטומה האדם מוזרק ישירות לתוך חלל הזגוגית של העיניים Murine טופס גידולים בתוך 2-4 שבועות. גידולים אלה ניתן לקצור ואו passaged נוספת לתוך העיניים Murine in vivo או מבוגר כמו tumorspheres במבחנה. רביה בוצעה בהצלחה על לפחות שלושה מעברים ובכך לבסס מקור מתמשך של רקמת רטינובלסטומה אדם לניסויים נוספים. ווסלי ס בונד לאליטה Wadhwa הם שיתוף ואחת מחברי.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice at JoVE.com

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

establishment-propagation-human-retinoblastoma-tumors-immune

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Views.  Baylor College of Medicine. השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

Video: Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

קולונוסקופיה גמישה בעכברים כדי להעריך את חומרת קוליטיס ומעי הגס גידולים באמצעות מערכת Validated אנדוסקופי ניקוד

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

יצירה אנטומית מדויק והשחזור תוך גולגולת xenografts של גידולים במוח אדם

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

אינדוקציה של טרשת עורקים מואצת בעכברים: מודל "פגיעת חוט"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.