רטינובלסטומה אנושית היא הסוג הנפוץ ביותר של סרטן תוך עיני בילדות. קשה להשיג דגימות קליניות ומודלים של עכברים אינם יכולים ליצור רטינובלסטומה. לכן, יצירת רטינובלסטומה במבחנה חיונית להתבוננות ביצירת רטינובלסטומה, שגשוגה וצמיחתה, ולפיתוח חומרים טיפוליים חדשניים.
היעילות של פרוטוקול זה יכולה להגיע לכ-100% אם כי משך הזמן ליצירת רטינובלסטומה משתנה מיום 45 ליום 120. לצורך תחזוקה של רטינובלסטומה אחת או RB נוקאאוט אחד של תאי גזע עובריים אנושיים, תרבית הגן ערך את H תשעה תאים בצלחת שש באר מצופה במטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה ושינוי המדיום מדי יום. כדי להעביר את התאים, לדגור אותם במאגר EDTA במשך 3.5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס או חמש דקות בטמפרטורת החדר.
תרבית את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 80%. לאחר מכן, כדי ליזום התמיינות תאי הרשתית, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן, העלו את מושבות התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ Dispase ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
התבונן במושבות התאים תחת מיקרוסקופ. ברגע שהקצוות של המושבות מתחילים להתגלגל החוצה, לשאוף את חיץ Dispase בעדינות לשטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של אחד בינוני לתוך הבאר באמצעות קצה פיפטה סטנדרטי של 10 מיקרוליטר, חותכים את המושבות לחתיכות.
השתמש במגרד תאים כדי לגרד את התאים הנותרים במדיום. קציר התאים על ידי צנטריפוגה בצינור 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, השאירו כ-50 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט כדי לפזר את התאים בתווך.
לאחר מכן מוסיפים 250 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה ומערבבים על ידי תסיסה עדינה. לאחר ערבוב, מניחים את צינור 15 מיליליטר עם התאים המרחפים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של 20 דקות, התאים ומטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הגדילה צריכים ליצור ג'ל מוצק.
לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של אחד בינוני לצינור 15 מיליליטר. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, פיפטה את הג'ל המתמצק פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפזר את הגוש. לאחר מכן מוסיפים עוד תשעה מיליליטר של בינוני אחד ומעבירים את מתלה התא לתוך צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים.
לדגור על המנה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. זה נחשב יום אפס. ביום הראשון, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ.
בממוצע, שלוש עד ארבע ציסטות נצפות בחתיכה אחת של ג'ל. ביום החמישי, לשנות את המדיום על ידי איסוף supernatant לתוך צינור 15 מיליליטר, המאפשר ציסטות להתיישב בתחתית ולהחליף את supernatant עם אחד בינוני טרי. מפזרים את הציסטות בצינור לשני כלים של 10 סנטימטרים, ומבטיחים לפחות 300 ציסטות בכל מנה.
ביום השביעי, רוב הציסטות המחוברות לצלחת מתפשטות ויוצרות מושבות דבקות. ביום 10, לשנות את המדיום עם אחד בינוני טרי, להבטיח כי כל ציסטות להישאר מחובר המנה. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ מימים 13 עד 17 כדי לוודא שהתאים מתפשטים.
ביום 15, לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS, להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת Dispase לדגור ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הסר את חיץ Dispase ולשטוף בעדינות את התרביות עם מיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר של בינוני שניים לכל צלחת 10 ס"מ ודוגרים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.
לאחר 24 שעות, תרבויות דבקות מתנתקות באופן ספונטני ומתכנסות לאורגנואידים ברשתית. שלושה ימים לאחר הניתוק, לאסוף את התאים מן צלחת תרבית התאים בצינור 15 מיליליטר. כאשר האורגנואידים מתיישבים, מוציאים את הסופרנאטנט מהצינור ומעבירים את האורגנואידים לצלחת פטרי חדשה שאינה דבקה עם 10 מיליליטר של בינוני שתיים במשך ארבעת הימים הבאים.
שבוע לאחר הניתוק, החליפו את המדיום למדיום לבינוני שלוש ומהיום ואילך, תרבו את האורגנואידים בבינוני שלוש. ביום ה-27 של תרבות האורגנואיד ברשתית, ארכיטקטורת השלפוחית האופטית ניכרת וכ-90% מהאורגנואידים מציגים מבנה זה. הגילוי הראשון של רטינובלסטומה מתרחש ביום 45 והוא הופך מוחשי ביום 50.
כאשר הוא גדל עד יום 90, מבני השלפוחית האופטית מקופלים בעיקר על ידי רטינובלסטומה. כיום ניתן לבודד את הרטינובלסטומה ולתרגם אותה בתרבית נוספת כקו תאים. ביום ה-105, יותר מ-80% מהאורגנואידים ברשתית עטופים במלואם ברטינובלסטומה.
אורגנואידים אלה מבטאים מאוד את סמן ההתפשטות Ki67 ואת סמן האונקוגן SYK בהשוואה לאורגנואידים ברשתית שמקורם ב-H, מה שמעיד על גידולים סרטניים. בנוסף, ביטוי גבוה של סמן מבשר החרוט ARR3 וסמן מבשר הפוטורצפטור CRX באורגנואידים של רטינובלסטומה מדגים כי מקורם בתאים מבשרי חרוט. תוצאות נחותות ומעולות במהלך שלושת השלבים המורפולוגיים של יצירת רטינובלסטומה מתוארות כאן.
ניתן להבחין בקלות בין תאי גזע עובריים אנושיים מובחנים ובלתי מובחנים על סמך המורפולוגיה שלהם. התאים הלא מובחנים נבחרים להיווצרות רטינובלסטומה. ביום החמישי, הכדור שנוצר צריך להיות חלול ולא מוצק.
הרטינובלסטומה נגזרת מהאורגנואידים ברשתית המציגים ארכיטקטורת שלפוחית אופטית. לא נוצרת רטינובלסטומה מהאורגנואידים הנחותים. בעת ביצוע ההליך, כל הטיפים צריכים להיות מקוררים ואת מטריצת קרום המרתף צריך להיות מומס בארבע מעלות לפני הוספת אותו לתוך הצינור.
זהו שלב מפתח בפרוטוקול בידול זה.
