עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (K22NS050137 כדי JCB).

1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים בקליפת המוח הם מבודדים גדל תוך שימוש בטכניקות שתוארו קודם לכן, מצופה על מנות תרבות עם תחתית זכוכית (MatTek Corporation, אשלנד, MA) מצופה פולי-D-ליזין laminin 1. </li></ol> 2. הכנת פתרונות מניות עבור בדיקות ניאון TMRM ו-H 2 DCF-DA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10 מ&quot;מ מניות של TMRM ידי המסת 5.0 מ&quot;ג TMRM ב 1 מ&quot;ל של dimethylsulfoxide נטול מים. זה וורטקס דקות 1. ואז, לעשות aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C, להגן מפני אור, להשתמש בתוך חודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין פתרון 10 מ&quot;מ מניות של H 2 DCF-DA ידי המסת 4.87 מ&quot;ג של H 2 DCF-DA ב 1 מ&quot;ל של DMSO נטול מים. באופן דומה, זה מערבולת דקות 1. ואז, לעשות aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C, להגן מפני אור, להשתמש בתוך שבוע. </li></ol> 3. עכברוש נוירונים בקליפת המוח Loading עם TMRM ו-H 2 DCF-DA TMRM הוא פוטנציומטרית, התא חדיר חיווי ניאון שמצטבר בפנים הטעונה שלילית של המיטוכונדריה. חשוב להשתמש בריכוזים נמוכים (10-50 טווח ננומטר) של TMRM להימנע אוטומטי של מרווה TMRM המיטוכונדריה. ואז, את האות פלואורסצנציה של TMRM ניתן ישירות שיתוף הקשורים ΔΨm על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית. אובדן ΔΨm גורם TMRM לדלוף מן המיטוכונדריה שגורם לאובדן של עוצמת הקרינה. H 2 DCF-DA הוא התא חדיר בדיקה להמרה DCF-DA ידי esterases תאיים, והתוצאות חמצון שלה DCF ניאון. הריכוז הסופי של H 2 DCF-DA נע בין 2-10 מיקרומטר ואת זה צריך להיבדק באופן אמפירי בנוירונים נגזר אזורי מוח שונים מאז ריכוזים טעינה גבוה יכול לגרום הרוויה של DCF הקרינה גם בהעדר של H 2 O 2. הנוכחות של חמצון אנדוגני או אקסוגני כלשהו (למשל, תחמוצת החנקן, חמצן) יגדיל DFC עוצמת הקרינה. להלן, אנו מספקים פרוטוקול לטעינת נוירונים בקליפת המוח עכברוש עם TMRM ו-H 2 DCF-DA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את הנוירונים עכברוש קליפת המוח עם TMRM, ראשית, לשטוף את נוירונים בתרבית 3 פעמים עם המאגר של Tyrode (שכבת טקסט: שחפת: 145 mM NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 10 גלוקוז מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ו - 10 HEPES מ&quot;מ; להתאים את pH עד 7.4 עם NaOH). לאחר מכן, להכין 20 ננומטר של TMRM על ידי דילול המניה 10 TMRM mM 1 / 1000 פעמים שחפת ולאחר מכן להוסיף 2 μl של TMRM המדולל מ&quot;ל 1 של שחפת. דגירה הנוירונים עם TMRM 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 45 דקות, הר צלחת התרבות על הבמה של המיקרוסקופ ולהתחיל הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את החולדה הנוירונים בקליפת המוח עם H 2 DCF-DA, לשטוף את נוירונים בתרבית 3 פעמים עם שחפת. בשלב הבא, להכין 2 מיקרומטר של H 2 DCF-DA על ידי דילול 10 מ&quot;מ H 2 DCF-DA המניה 1 / 10 פעמים שחפת ולאחר מכן להוסיף 2 μl של בדילול H 2 DCF-DA לכל 1 מ&quot;ל של שחפת. ואז, דגירה הנוירונים עם H 2 DCF-DA 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 45 דקות, לשטוף את הנוירונים 4 פעמים עם שחפת להסיר אינדיקטור ניאון עודף לפני קבלת תמונות. </li></ol> 4. הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם TMRM לקבוע ΔΨm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם TMRM, לייזר confocal מיקרוסקופיית (שכבת טקסט: LSM 510, Carl Zeiss Inc), עם יישום התוכנית בזמן סדרת לחיות, משמש. החל ברזולוציה נמוכה ו נחלש כוח לייזר (שכבת טקסט: רזולוציה נמוכה: 256 x 256; כוח לייזר: 1%) כדי לצמצם את הזמן הדרוש כדי להשיג תמונות ולהימנע photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . בשלב הבא, לכוון את הפוקוס של הנוירונים רכוב עמוסה TMRM באמצעות האור המוחזר. בדוק את הקרינה TMRM על ידי תאורה ב 514 ננומטר וזיהוי ב 570 ננומטר. קבע את הרווח זיהוי של מצלמה מתחת לרמת רוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הפרמטרים אשר כוללים רזולוציה, כוח לייזר, להשיג זיהוי של מצלמה, זמן לשגות מרווח כדי להשיג תמונות מוגדרות, אין לשנות הגדרות אלה בין הניסויים. בשלב הבא, לשנות את השדה. התחל באיסוף התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את השינויים ΔΨm, גירויים כגון 1 מיקרומטר של FCCP או 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של oligomycin, יכול להיות מיושם, אשר ישפר משמעותית depolarize או hyperpolarize פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, בהתאמה. שינויים אלה יבואו לידי ביטוי על ידי ירידה בעוצמת הקרינה TMRM לעומת עוצמת הקרינה הבסיס במקרה של FCCP, או עלייה בעוצמת הקרינה TMRM במקרה של oligomycin. </li></ol> 5. הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם H 2 DCF-DA לקבוע ROS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם H 2 DCF-DA, הראשון, הר צלחת התרבות על הבמה של מיקרוסקופ. התאם את המיקוד של התאים לנוing משתקף האור. בדוק DCF הקרינה על ידי עירור ב 488 ננומטר ופליטה ב 515 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להתאים את כוח לייזר 5-7%, עלייה גלאי, ברזולוציה של 256 x 256. אין לשנות הגדרות אלה בין הניסויים. לאחר מכן, קבע את תדר לקבלת תמונות חיות באמצעות תוכנית סדרת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שדה חדש ולהתחיל לרכוש תמונות. כדי לזהות שינויים ברמות ROS, לטפל בתאים עם 100-200 מיקרומטר של H 2 O 2. זה יבוא לידי ביטוי על ידי עלייה בעוצמת הקרינה DCF, לעומת רמת הבסיס. </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזור של עניין (שכבת טקסט: ROI) כלי מהתוכנית LSM כדי לבחור את אזורי. לאחר מכן, מודדים את TMRM או ROS עוצמות הקרינה. בחר ROIs מאזורים המיטוכונדריה או ROIs מגוף התא כולו בתאים הדמיה כדי למדוד את עוצמות הקרינה של TMRM או ROS, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את עוצמות הקרינה הממוצעת ROIs כל תא עבור TMRM או מגופים תא שלם עבור כל התאים הדמיה עבור ROS לכל נקודת זמן. בחר באזורים ליד התאים כדי לחשב את עוצמת הקרינה רקע. קח כמה מדידות ולחשב את עוצמת רקע הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הרקע ממוצע עוצמת הקרינה של עוצמות הקרינה הממוצעת של ROIs בכל תא עבור כל נקודת זמן באמצעות Microsoft Excel. לאחר הפחתת עוצמת רקע, לנרמל את עוצמת TMRM או DCF פלואורסצנטי הקרינה הבסיס באמצעות הנוסחה (שכבת טקסט: ΔF FF = o / F o x 100, שם F = עוצמת הקרינה בכל נקודת זמן, במשך = הבסיס הקרינה). ואז, להשתמש בתוכנית מגרש Sigma כדי ליצור את העלילה מראה את השינויים בעוצמת הקרינה לאורך זמן. </li></ol> 7. נציג תוצאות איור 1 א מציג תמונה הקרינה של נוירונים בקליפת המוח עכברוש מודגרות עם TMRM. הוספת FCCP, uncoupler המיטוכונדריה, מוביל שלילת קוטביות המיטוכונדריה לבין הפסד של עוצמת הקרינה TMRM (איור 1B). הרמה הבסיסית TMRM הקרינה נותר יציב לפני תוספת של FCCP (הראשון 350 שניות;. איור 1C). ניתוח כמותי של שינויים TMRM הקרינה לאורך זמן מראה ירידה משמעותית הקרינה TMRM לאחר תוספת של FCCP (איור 1C). 1D איור מראה את התמונה פלואורסצנציה של נוירונים בקליפת המוח עכברוש עמוסה DCF. תוספת של H 2 O 2 תוצאות מוגברת עוצמת הקרינה DCF בגוף התא (איור 1E). הרמה הבסיסית DCF הקרינה היא ללא שינוי (הראשון 120 שניות) לפני היישום של H 2 O 2. זמן לשגות מדידות של הקרינה DCF להראות רמת סוכר קבועה שלה, להגדיל לאחר הטיפול H 2 O 2 (איור 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ורמות ROS בנוירונים חולדה חיה קליפת המוח. (א) נציג תמונה הקרינה של נוירונים בקליפת המוח עמוסה TMRM. לאחר הסריקה הבסיסית TMRM פלואורסצנטי, הנוירונים טופלו FCCP protonophore (1 מיקרומטר). מימין הוא סרגל עוצמת הקרינה של pseudocolor TMRM עם מקסימום בהיר המייצג צהוב ושחור ואת עוצמת המינימום, בהתאמה. ההפסד של הקרינה TMRM מאזורי המיטוכונדריה מצביע על קריסת ΔΨm על FCCP הטיפול (לוח ב &#39;). ייצוג כמותי של שינוי בעוצמת הקרינה TMRM בנקודות זמן שונות לפני ואחרי הטיפול FCCP מוצגת בלוח ג (ד) תמונה פלואורסצנטי של נוירונים בקליפת המוח עכברוש עמוסה H2DCF-DA. לאחר קביעת הבסיס DCF פלואורסצנטי, בתאים שטופלו 200 מיקרומטר H 2 O 2, והשינוי DCF הקרינה הוערך. גידול הקרינה DCF משקף את העלייה ברמות ROS על טיפול 2 H 2 O (E). ניתוח כמותי של שינוי DCF פלואורסצנטי, לפני ואחרי הטיפול H 2 O 2, מוצג בשורת פאנל סולם פ = 10 מיקרומטר Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi הדמיה של תא חי TMRM בתוך הנוירונים בקליפת המוח לפני ואחרי בנוסף FCCP באמצעות המטרה 40X. עוצמת pseudocolor מראה (צהוב בהיר, לפני כן FCCP) המרבי וירידה (צבע אדום, לאחר תוספת FCCP) עוצמת הקרינה לאחר TMRM בנוסף FCCP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">לחץ כאן כדי להציג וידאו</a> וידאו. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi הדמיה של תא חי DCF בתוך הנוירונים בקליפת המוח לפני ואחרי בנוסף 2 H 2 O באמצעות המטרה 40X. הבסיס DCF הקרינה יש צבע ירוק בהיר בגוף התא H2O2 בנוסף מגדיל את הבירהF עוצמת הקרינה לצבע ירוק בהיר. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">לחץ כאן כדי להציג וידאו</a>

<ol>
	<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures.">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+(AICD)+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics.">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li><li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species:+implication+for+cell+death.">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הצגנו הליך צעד אחר צעד מתאר כיצד לקבוע ΔΨm ו ROS ב נוירונים בקליפת המוח עכברוש באמצעות אינדיקטורים פלורסנט TMRM ו-H 2 DCF-DA, בהתאמה. עבור סוגי תאים אחרים, חשוב לקבוע באופן אמפירי את הריכוז הסופי זמן טעינה עבור TMRM או H 2 DCF-DA. באופן כללי, טווח הריכוזים TMRM 2-20 ננומטר, ואת זמן הדגירה תא עם TMRM משתנה בין 20 ל 60 דקות. הריכוז הסופי של H 2 DCF-DA טווחי 2-10 מיקרומטר, ו הדגירה של תאים בתמיסה המכילה טעינת זה סמן משתנה בין 30-45 דקות. זה חשוב כדי לייעל את כוח לייזר מהירות סריקה של לקיחת התמונות להימנע הן צילום רעילות לתאי שינויים בעוצמת הקרינה (למשל הבהוב של TMRM פלואורסצנטי) בהעדר גירוי כלשהו. ההגדרות אופטי אופטימיזציה צריך להביא אות הקרינה כי הוא לא מעל או מתחת רווי (סף) בהיעדר גירוי. תנאים אופטימליים כדי לאסוף את התמונות משדה שנבחר בהספק לייזר בפרט מהירות סריקה מושגות כאשר אין שינויים בעוצמת הקרינה של החללית בהעדר גירוי כלשהו עבור 10-15 דקות של הדמיה לחיות. בדיקות הקרינה אחרים כדי לקבוע ΔΨm כוללים rhodamine 123 ו טטרה מתיל אתיל אסתר rhodamine (TMRE). עם זאת, הם נמצאו לעכב את תהליכי הנשימה 2 המיטוכונדריה מבודד. חשוב לציין, TMRM אין כל השפעה על הנשימה המיטוכונדריאלי בריכוזים נמוכים 2 ויש לו phototoxicity נמוך photobleaching 3 לעומת בדיקות אחרות. H 2 DCF-DA הוא אינדיקטור טוב עבור ROS כפי שהיא נשמרת גם בתאים ומזהה מינים חמצון שונים, כגון peroxides, תחמוצות סופר, ו תחמוצת החנקן 4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> תחתית זכוכית תרבות צלחת </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons

פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (ΔΨm) היא קריטית לשמירה על תפקוד פיזיולוגי של שרשרת הנשימה כדי ליצור ATP. באובדן משמעותי של תאים הופך ΔΨm מדולדל של אנרגיה עם המוות הבאים. מינים חמצן מגיב (ROS) הם מולקולות איתות חשוב, אך הצטברות שלהם במצבים פתולוגיים מוביל סטרס חמצוני. שני המקורות העיקריים של ROS בתאים הם רעלים סביבתיים בתהליך של זרחון חמצוני. תפקוד המיטוכונדריה לבין סטרס חמצוני היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, ולכן היכולת לקבוע ΔΨm ו ROS יכולים לספק רמזים חשובים על מצב פיזיולוגי של התא ועל תפקידו של המיטוכונדריה. בדיקות ניאון כמה (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) ניתן להשתמש כדי לקבוע Δψm במגוון רחב של סוגי תאים, ואינדיקטורים רבים פלואורסצנטי (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) ניתן להשתמש כדי לקבוע ROS . כמעט כל בדיקות הקרינה זמין להערכת ΔΨm או ROS הם אחד האינדיקטורים גל, אשר להגדיל או להקטין את עוצמת הקרינה שלהם ביחס לגירוי אשר מגביר או מקטין את רמות ΔΨm או ROS. לכן, זה הכרחי למדוד את עוצמת הקרינה של בדיקות אלה ברמה בסיסית ואחרי היישום של גירוי מסוים. זה מאפשר לקבוע את אחוז השינוי בעוצמת הקרינה בין רמת המחקר ולאחר גירוי. השינוי בעוצמת הקרינה משקף את השינוי ברמות היחסי של ΔΨm או ROS. בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך ליישם את מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח חולדה כדי לקבוע את אחוז השינוי בעוצמת הקרינה TMRM בין רמת המחקר ולאחר יישום FCCP, uncoupler המיטוכונדריה. רמות נמוכות של פלואורסצנציה TMRM כתוצאה מטיפול FCCP לשקף את שלילת קוטביות של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כמו כן, אנו מראים כיצד ליישם את הקרינה בדיקה H 2 DCF-DA כדי להעריך את רמת ROS בתוך הנוירונים בקליפת המוח, הראשון בתחילת המחקר ולאחר מכן לאחר היישום של H 2 O 2. פרוטוקול זה (עם שינויים קלים) יכול לשמש גם כדי לקבוע שינויים ΔΨm ו ROS בסוגי תאים שונים בנוירונים מבודד מאזורים אחרים במוח.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

אנו מדגימים יישום מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח כדי לקבוע את השינויים יחסית בעוצמת הקרינה TMRM לפני ואחרי יישום של גירוי מסוים. אנחנו גם מראים יישום בדיקה הקרינה H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA להעריך את הרמה היחסית של מינים החמצן מגיב על נוירונים בקליפת המוח.

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

64.7K Views.  Loyola University Chicago. אנו מדגימים יישום מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח כדי לקבוע את השינויים יחסית בעוצמת הקרינה TMRM לפני ואחרי יישום של גירוי מסוים. אנחנו גם מראים יישום בדיקה הקרינה H 2 DCF-DA להעריך את הרמה היחסית של מינים החמצן מגיב על נוירונים בקליפת המוח.

Video: Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

גירוי מדויק של קליפת העין הקורטיקלית פוטנציאל מורפולוגיים

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...