החוקרים מעריכים קריאה לסגור ד&quot;ר Lynnea של Brumbaugh של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים EB000712 R01, R01 EB008085, R01 CA134539, U54 CA136398 ו 5P60 DK02057933. פרופ &#39;Lihong V. וואנג יש אינטרס כלכלי Microphotoacoustics, Inc Endra, Inc, אשר, עם זאת, לא תמך את העבודה הזאת.

1. תצורת מערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטי קרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקור קרינה אופטי: דיודת-שאוב מצב מוצק פעמו לייזר (INNOSLAB, Edgewave) ו לייזר צבע (CBR-D, סירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרן לייזר פלט (רוחב הדופק: 7 ns) ממוקדת על ידי עדשה מעבה (LA1131, Thorlabs) לעבור דרך חריר 50 מיקרומטר (P50C, Thorlabs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חריר ממוקמת מעט מן המוקד של העדשה הקבל כדי להתאים את קוטר חריר בקוטר יסוד מצב הקורה לסינון מרחבי יעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרן מסוננת הוא נחלש על ידי מסנן צפיפות ניטרלי (NDC-50C-2M, Thorlabs) ולאחר מכן מצמידים לתוך סיב יחיד במצב אופטי (P1-460A-FC-2, Thorlabs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוקת סיבים ממלא את הצמצם חזרה המטרה מיקרוסקופ (RMS4X, Thorlabs) כדי להשיג מוקד עקיפה מוגבל אופטי של ~ 2.6 מיקרומטר באורך גל של 570 ננומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי קולי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתמר Ultrasonic: 50-MHz בתדר המרכזי (V214-BB-RM, Olympus-NDT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתמר קולי מצורף תוצרת בית אקוסטית אופטי קרן combiner 11 עבור זיהוי קולי, אשר מיושר coaxially עם הקרנה-עקיפה מוגבל אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלל כדורית היא קרקע מתוך בתחתית combiner כדי לייצר עדשה אקוסטית. זו עדשה אקוסטית יש הצמצם המספרי של 0.5 במים ונותן בקוטר מוקד אקוסטי של 43 מיקרומטר בתדר המרכזי 50-MHz. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוקדים אופטיים אקוסטי מיושרים confocally על מנת למקסם את רגישות הזיהוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקוסטית צימוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צימוד קולי יבש מועסק כדי למנוע הצללה חיות הניסוי במים, ששימש בתחילת מערכות הדמיה photoacoustic 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון הדמיה נפתח החלק התחתון של צלחת פטרי (9 ס&quot;מ קוטר), והוא חתום עם קרום ultrasonically ו אופטית פוליאתילן שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל Ultrasonic (תמונה ברורה, SonoTech) בין הממברנה פוליאתילן את האובייקט להיות זוגות צילמו את גל photoacoustic שנוצר האובייקט צלחת פטרי, ומים deionized בצלחת פטרי זוגות עוד גל של ראש שקוע הדמיה OR-PAM . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרוניקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האות photoacoustic זוהה על ידי מתמר קולי מוגבר על ידי שני מגברי מדורגות (ZFL 500LN, Mini-Circuits) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האות מוגבר הוא דיגיטציה על ידי רכישת נתונים 14 סיביות (DAQ) הלוח (CompuScope 14200, גייג&#39; יישומית למדעים) בקצב דגימה של 200 MS / s. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דו מימדי (2-D) סריקה סריקה של הראש או הדמיה-PAM לאורך מישור (xy) אופקי נשלטת על ידי מחשב אישי, אשר מפעילה גם את הלוח DAQ ואת לייזר המשאבה. האות ההדק מסונכרן עם אות השעון את מהלוח DAQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציר מהיר של הסורק 2-D מוגדר לכיוון לסרוק חתך (B-scan). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף של B-לסרוק תמונות ניתן נרכשה על ידי מתרגם את הראש הדמיה לאורך ציר איטי כדי ליצור תמונה volumetric, אשר ניתן לצפות גם בעיבוד 3-D ישיר או הקרנה 2-D המרבי משרעת (MAP) תמונה . </li></ol></li></ol> 2. מערכת יישור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הדופק הד אולטרסאונד רפלקטור קולי כדי לקבוע את המיקום של המטוס מוקד אקוסטי (כלומר, העיכוב זמן מן האות על ההדק לאות הדופק המרבי הד קולי). צעד זה נדרש להתבצע רק פעם אחת בעת בניית המערכת או-PAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקסם את היעילות של צימוד סיבים במצב יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ג&#39;ל קולי על גבי אובייקט אופטית סופג (למשל, נייר דבק שחור) בעדינות לצרף אותו מתחת לחלון ההדמיה בצלחת פטרי מלא מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הראש הדמיה לתוך המים, להסיר בועות אוויר שנלכדו תחת העדשה אקוסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הראש הדמיה עד האות photoacoustic של האובייקט הוא סופג מהמטוס מוקד אקוסטי, אשר יכול להישפט מן העיכוב אקוסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את המיקום האנכי (כלומר, העמדה z) המטרה מיקרוסקופ כדי למקסם את המשרעת של האות photoacoustic שנוצר אובייקט שטוח. משרעת האות מוגדל עולה כי מוקד אופטי מיושר עם המוקד אקוסטי בכיוון אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עמדות האופקי (עמדות כלומר, x ו-y) המטרה מיקרוסקופ עד האות photoacoustic שנוצר מהיעד מציג דפוס סימטרי. סימטריה עולה כי מוקד אופטי מיושר עם המוקד אקוסטי בכיוון אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.6 ו - 2.7 עד האות photoacoustic מותאם בסימטריה והן המשרעת. </li></ol> 3. Sa<html> הליך הניסוי mple-in vivo OR-PAM של העכבר לאוזן vasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה לא נדרש עכברים בעירום. להרדים את החיה עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל [מתכון: 1 מ&quot;ל קטמין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 0.1 מ&quot;ל xylazine (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ו - 8.9 מ&quot;ל תמיסת מלח; מינון: 0.1 ml/10 g]. לגלח את השיער באוזן, ועוד להשיר שער השיער שיורית עם קרם Surgi (קטגוריה #: 82565, American International Industries) לפני ניקוי עם מים deionized. שים לב depilation כזה עלול קצת לגרות את העור ובכך vasculature מבוצע הכי טוב 24 שעות לפני הניסוי המתוכנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת הלייזר photoacoustic, ולבדוק את מערכת היישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם 3% isoflurane מתאדה על ידי שאיפת גז (את קצב הזרימה אופיינית היא 1.0-1.5 ליטר / דקות, תלוי במשקל הגוף של בעל החיים), ולשמור על הרדמה עם 1% isoflurane לאורך הניסוי. הרפואי כיתה אוויר מומלץ כמו משאיפת הגז כדי לשמור את העכבר על הסטטוס פיזיולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר לשלב stereotactic, שליטה בטמפרטורת הגוף שלה ב 37 מעלות צלזיוס עם כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחו את האוזן העכבר על צלחת פלסטיק למרוח שכבה של ג&#39;ל אולטרסאונד על גבי האוזן. הימנע השמנה בועות אוויר בתוך הג&#39;ל. ואז, במקום אוזן מתחת לחלון ההדמיה ולאט לאט להעלות את הבמה החיה עד ג&#39;ל הקשר אולטרסאונד התחתון של קרום פוליאתילן. מגע רך נדרש כי לחיצה על אוזן נגד הקרום עשוי להשפיע על זרימת הדם באוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ oximeter הדופק ברגל או זנב עכבר לפקח המצב הפיזיולוגי שלה, ולהחיל משחה לעיניים למניעת יובש נזק מקרי לייזר לעיניים העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הראש עד הדמיה העדשה אקוסטי הוא שקוע במים deionized, ולהסיר בועות אוויר שנלכדו תחת העדשה אקוסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השטף לייזר כדי לוודא שהוא בתוך תקני בטיחות לייזר של המוסד לתקינה האמריקאית מכון 13. השטף לייזר לא יעלה על 20 mJ / 2 ס&quot;מ, אשר מיתרגם 80 NJ אנרגיה הדופק לייזר כאשר קרן הלייזר ממוקדת על 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח של העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לייזר מצב חיצוני-ההדק ולהתחיל סריקה לדין. לשנות את מיקום z של ראש הדמיה עד האות החזק ביותר הוא photoacoustic מהמטוס מוקד אקוסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פרמטרים סריקה נכונה ולהתחיל רכישת תמונה רשמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי, לכבות לייזר, להרים את הראש הדמיה מהמים deionized, מנמיכים את שלב בעלי חיים כדי לשחרר את העכבר, לנקות את האוזן עם העכבר deionized מים, לכבות את המערכת הרדמה בקר טמפרטורה, ולפרוק את העכבר משלב stereotactic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה חוזרות נדרש, לשים את העכבר באינקובטור עם טמפרטורת הסביבה נקבע על 37 ° C. החזר את העכבר למתקן חיה לאחר מתעורר באופן טבעי. אחרת, בצע את הפרוטוקולים החיה euthanatize ו להיפטר ממנו. </li></ol> 4. פונקציונלית OR-PAM של ריכוז מוחלט רווית החמצן של המוגלובין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oxyhemoglobin (HBO 2) ו deoxyhemoglobin (HBr) הן שתי הצורות העיקריות של המוגלובין, המקור העיקרי photoacoustic אנדוגני בטווח הספקטרום הנראה. HBO 2 ו HBr יש קליטה שונים הספקטרום האופטי, ולכן יכול להיות מובחן spectrally לכמת גם את הריכוז הכולל (HBT) ואת הרוויה חמצן (SO 2) של המוגלובין 5. להלן שתי הנחיות כדי לעזור לבחור האור הנראה ראוי כל כך 2 מדידות: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורכי גל יש לבחור בתוך הלהקה-Q של הספקטרום המוגלובין קליטה (כלומר, 550-600 ננומטר), כדי להבטיח יחס מספיק אות לרעש וחדירה הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורכי גל בו מקדמי הספיגה של HBO 2 ו HBr יש הבדל מובהק (למשל, HBr, דומיננטי 561 ננומטר 2-HBO דומיננטי 578 ננומטר) מומלץ. </li></ol> חוץ מזה כל כך 2, HBT יכול להיות מחושב על ידי הוספת [HBr] ו [HBO 2] יחד, או שהוא ניתן למדוד ישירות באורכי גל isosbestic של ספקטרה מקדם טוחנת הכחדה של המוגלובין (למשל, 530 nm, 545 nm, 570 nm, ו 584 ננומטר) 14, שם HBr ו-HBO יש 2 שווים מקדמי הכחדה טוחנת. 5. נציג תוצאות: שמוצג באיור 1 הוא אנטומיה של כלי הדם ועוד 2 באוזן עכבר חי צילמו בעירום באמצעות כפול אורך הגל (561 ו - 570 ננומטר) או-PAM. תמונה אופיינית רכישת זמן אורך הגל כפול כך 2 מדידות של אזור כזה עניין (גודל התמונה: 10 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ; גודל הצעד: 2.5 מיקרומטר x 5 מיקרומטר) הוא ~ 80 דקות. p_upload/2729/2729fig1.jpg &quot;alt =&quot; איור 1 &quot;/&gt; איור 1. מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה vivo photoacoustic. MAP תמונות של ריכוז (א) המוגלובין הכולל מראה את האנטומיה של כלי הדם (נרכשה ב 570 ננומטר) ו - (ב) את החמצן המוגלובין הרוויה (נרכשה ב 561 ננומטר 570 ננומטר) באוזן עכבר בעירום. (ג) תקריב של האזור התאגרף בלוח (A). סרגל מידה בלוח (א) חלה הן (א) ו - (ב).

<ol>
	<li>Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-resolution+photoacoustic+microscopy+for+in+vivo+imaging+of+single+capillaries.">Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries.</a> Opt. Lett. 33, 929-931 (2008).</li><li>Zhang, C., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subwavelength-resolution+label-free+photoacoustic+microscopy+of+optical+absorption+in+vivo.">Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo.</a> Opt. Lett. 35, 3195-3197 (2010).</li><li>Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+photoacoustic+and+fluorescence+confocal+microscopy.">Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy.</a> IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57, 2576-2578 (2010).</li><li>Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multimodal+imaging+with+integrated+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography.">Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography.</a> Opt. Lett. 34, 2961-2963 (2009).</li><li>Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcranial+brain+imaging+by+optical-resolution+photoacoustic+microscopy.">Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 14, 040503-040503 (2009).</li><li>Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J. M., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+amyloid+plaques+in+a+transgenic+mouse+model+using+optical-resolution+photoacoustic+microscopy.">Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> Opt. Lett. 34, 3899-3901 (2009).</li><li>Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Photoacoustic+Ophthalmic+Angiography.">Label-free Photoacoustic Ophthalmic Angiography.</a> Opt. Lett. 35, 1-3 (2010).</li><li>Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+ophthalmoscopy+for+in+vivo+retinal+imaging.">Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging.</a> Opt. Express. 18, 3967-3972 (2010).</li><li>Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., Arbeit, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+HIF-1+induction+produces+multistage+neovascularization+with+stage-specific+sensitivity+to+VEGFR+inhibitors+and+myeloid+cell+independence.">Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence.</a> Blood. , .</li><li>Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+chronic+imaging+of+a+small+animal+model+using+optical-resolution+photoacoustic+microscopy.">In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> Med. Phys. 36, 2320-2323 (2009).</li><li>Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+optical-resolution+photoacoustic+microscopy+with+improved+sensitivity+and+speed.">Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed.</a> Opt. Lett. 36, 1134-1136 (2011).</li><li>Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+laser-induced+photoacoustic+tomography+for+structural+and+functional+in+vivo+imaging+of+the+brain.">Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain.</a> Nat. Biotechnol. 21, 803-806 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136. , (2007).</li><li>Jacques, S. L., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Absorption+of+Hemoglobin+.">Optical Absorption of Hemoglobin .</a> Oregon Medical Laser Center [Internet]. , (1999).</li></ol>

הנהלים כל חיית ניסוי בוצעו התאמה עם פרוטוקול מעבדה חיה שאישרה הספר לרפואה בעלי חיים מחקרים ועדת מאוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.

בסרטון הזה, אנו מספקים הדרכה מפורטת על פרוטוקולי הניסוי של OR-PAM, לרבות תצורת המערכת, יישור המערכת, הפרוצדורות טיפוסי. OR-PAM ללא תווית, לא פולשנית אפשרה מחקרים של תפקוד כלי הדם ואת חילוף החומרים על בסיס נימי יחיד ובכך בעל פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של microcirculation הקשורות ?...

בית מתוצרת אקוסטי אופטי קרן combiner: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזווית ישרה פריזמה (NT32-545, אדמונד אופטיקה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעוין פריזמה (NT49-419, אדמונד אופטיקה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן סיליקון (1000cSt, מוצרים Clearco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> OR-PAM המערכת (Microphotoacoustics) </li></ul>

three-dimensional optical-resolution photoacoustic microscopy

מיקרוסקופיה אופטית, לספק תובנות רבות ערך ברמות הסלולר אברון, הוכרה באופן נרחב כטכנולוגיה המאפשרת ביו. מאחר התווך של in vivo תלת ממדי (3-D) מיקרוסקופיה אופטית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי single-/multi-photon ו טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) הראו רגישות יוצאת דופן שלהם ניגודים פיזור הקרינה אופטיות, בהתאמה. עם זאת, בניגוד קליטה אופטי של רקמות ביולוגיות, אשר מקודד מידע פיזיולוגיות / פתולוגי חיוני, טרם שומתי. הופעתם של photoacoustics ביו הוביל ענף חדש של מיקרוסקופיה אופטית מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) 1, שם הקרנה ממוקדת אופטי להגביל את עקיפה להשיג הסלולר subcellular 1 או אפילו 2 ברזולוציה רמת לרוחב. כהשלמה ערך הקיימות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה אופטית, OR-PAM מביאה לפחות שני חידושים. ראשית, וחשוב מכל, OR-PAM מזהה ניגודים קליטה אופטית עם רגישות יוצאת דופן (כלומר, 100%). שילוב OR-PAM עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3 או עם פיזור אופטי מבוסס אוקטובר 4 (או עם שניהם) מספק תכונות אופטיות מקיפה של רקמות ביולוגיות. שנית, OR-PAM מקודד קליטה אופטית לתוך גלים אקוסטיים, בניגוד לתהליכי אופטי טהור מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו אוקטובר, ומספק רקע ללא זיהוי. גילוי אקוסטי של OR-PAM מפחית את ההשפעות של פיזור אופטי על השפלה האות טבעי מבטל הפרעות אפשרי (כלומר, crosstalks) בין עירור וגילוי, המהווה בעיה נפוצה מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשל חפיפה בין עירור ואת ספקטרום הקרינה. ייחודי עבור הדמיה קליטה אופטית, OR-PAM הוכיחה יישומים ביו רחב מאז המצאת שלה, כולל, אך לא מוגבל, נוירולוגיה 5, 6, עיניים 7, 8, 9 וסקולרית ביולוגיה, ו -10 דרמטולוגיה. בסרטון הזה, אנו מלמדים את תצורת המערכת ויישור של OR-PAM, כמו גם את נהלי ניסיוני בתחום ההדמיה כלי הדם vivo תפקודית.

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy at JoVE.com

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) היא טכנולוגיה המתעוררים מסוגל קליטה הדמיה אופטית ניגודים<em&gt; In vivo</em&gt; עם רזולוציה רגישות הסלולר. כאן, אנו מספקים הדרכה דמיינו על פרוטוקולי הניסוי של OR-PAM, כולל תצורה יישור מערכת מערכת, טיפוסי<em&gt; In vivo</em&gt; הפרוצדורות, וערכות הדמיה תפקודית.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

three-dimensional-optical-resolution-photoacoustic-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.7K Views.  Washington University in St. Louis. מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) היא טכנולוגיה המתעוררים מסוגל קליטה הדמיה אופטית ניגודים In vivo עם רזולוציה רגישות הסלולר. כאן, אנו מספקים הדרכה דמיינו על פרוטוקולי הניסוי של OR-PAM, כולל תצורה יישור מערכת מערכת, טיפוסי In vivo הפרוצדורות, וער...

Video: Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Cystography photoacoustic

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

רזולוציה אקוסטית ואופטית למיקרוסקופיה פוטוקוסטית עבור<em&gt; בויבו</em&gt; בעלי חיים קטנים דם Vasculature הדמיה

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.