עבודה זו מומנה על ידי תמיכה באמצעות קרן מקניר, NARSAD ו NINDS מענק R00NS064171-03.

1. קיבעון במוח באתרו * היכונו מזרק 10 מ&quot;ל (28 מחט מד) מלא שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). * היכונו מזרק 10 מ&quot;ל (28 מחט מד) מלא paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS. שמורת 5-10 מ&quot;ל נוספים של PFA / PBS עבור קיבעון הודעה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally עכבר ניסיוני עם מינון קטלני של Avertin או נמבוטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עכבר מסומם, להרטיב את הבטן עם אתנול לאבטח את העכבר לתחתית מגש שכבתית עם פקק, שעווה, או אלסטומר סיליקון באמצעות סיכות לנתיחה. עם הבטן כלפי מעלה, להבטיח את ארבע כפות רגליים אל פני השטח - להפיץ אותם רחב ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את העור עם מלקחיים ברמה של עצם החזה, חתך לרוחב כדי לחשוף את הכבד. גזור רוחבית ואז דרך הצלעות והסרעפת. הסר את יריעת רקמה הצלעות וממשיכים חיתוך עד הלב נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס או לגזור אטריום הזכות ניקוז הדם שהופץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש דם שיורית ממערכת הדם על ידי טפטוף של PBS דרך החדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה חור מחט אותו, לתקן את העכבר על ידי כל זלוף הבאות של PBS / PFA דרך החדר השמאלי. </li></ol> 2. Dissection והוצאה המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור מן הראש, הצוואר, הגולגולת על ידי חיתוך סביב תעלת האוזן ואת העין מסלולים, ואחריו מושך עור anteriorly לחשוף את הגולגולת. * ראה איור 2 להמחשה צעדים 2.2) ל 2.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים העצם, חתך לרוחב מהעין דרך שקע חלזוני עצמות האף. האם זה עבור כל צד. במסור צריך להיות הקדמי של העיניים נורות חוש הריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לאורכם של תעלת האוזן כל לשקע העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה קטן, לחתוך את צלחת עצם העורף שכיסה את המוח הקטן של תעלת אוזן אחת לשנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים לנתיחה אותו, לחתוך anteriorly לאורך קו האמצע לרמה של הנורות חוש הריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר כל צלחת עצם מהמוח, מקפיד להסיר את כל רקמת החיבור כך המוח נשאר שלם כאשר מרימים את העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצבים Snip אופטיים גולגולתי, לחתוך את חוליות הצוואר העליון, ולהסיר את המוח לתוך מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיקון 1-2 שעות ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים 15 דקות כל אחד PBS. </li></ol> 3. Agarose הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2% חוזק גבוה, נמוך ג&#39;ל נקודת agarose סוג IB (מספר קטלוג סיגמא: A0576) ב-PBS מלוחים עם מיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת agarose מותך אל מבחנה. מבחן מקום צינור באמבטיה חממה או מים חמים (40 ° -41 ° C) עד איזון הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק רקמות מוח קבוע על הבוכנה של מזרק את הדגימה עם דבק cyanoacrylate (איור 3A). מברשת שכבה דקה של פתרון סוכרוז-PBS רווי על פני השטח של רקמת המוח כדי להקל על שחרור מאוחר של הטבעת agarose מן פרוסות המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הבוכנה עם רקמת המוח לתוך דיור על הבוכנה (איור 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה או לשפוך agarose חם לתוך דיור על הבוכנה, מכסה את רקמת המוח. הימנע השמנה בועות אוויר לתוך agarose. בועות האוויר agarose תתפשר על איכות פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את המזרק עם הדגימה (0 ° ל -25 ° C) קר לחסום מצמרר דקה 1 כדי להגדיר את agarose (איור 3 ג). </li></ol> 4. חתך פרוסה המוח עם Compresstome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המזרק הדגימה המכיל את רקמת המוח לתוך Compresstome (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את קצה של סכין הגילוח הדוק עם היציאה של מזרק את הדגימה (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את המכל חיץ עם פתרון PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב אחד מיקרומטר עובי פרוסת קדימה כדי לחסום extrude-agarose רקמת המוח מתוך מזרק את הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על כפתור &quot;התחל&quot; על יחידת הבקרה של Compresstome כדי ליזום את תהליך חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.4) ל 4.5) עד פרוסות הרצוי מתקבלים לקבוע עובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח קציר פרוסות עם מברשת או פיפטה כדי צלוחיות או בארות מכתים מלא PBS (איור 3F). </li></ol> 5. אופטי מסלקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כרך 75%: פתרון כרך של גליצרול: PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים (או פיפטה) את נפח מחצית PBS לשטוף מן פרוסות המוח שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף האחורי נפח הסיר עם גליצרול / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לאזן עם ערבוב עדין על 4 מעלות צלזיוס עד כיור הפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.2) ל 6.4) עד ריכוז גליצרול הסופי מגיע 75%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף פתרון עם גליצרול 90% ב-PBS ולאפשר לאזן. * הערה: הקפד לא להכניס בועות אוויר תוך הוספת פתרונות גליצרול. יוצקים פתרונות לאט ומערבבים בעדינות, מאז בועות אוויר יפריע אחיד equilibration ו יבוצעו על להחליק גובר. </li></ol> 6. פורסים הרכבה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור פעמיים צדדית דבק חותם (SA-S-1L, גרייס Bio-Labs) למלבן פתוח כדי להתאים את סביבות לצפייה של שקופית מיקרו (Superfrost בנוסף, 25 X 75 X 1, חתול מ&quot;מ. # 48311-703, VWR ) עם הצדדים 2-3 מ&quot;מ רוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסות המוח בתוך במרכז המלבן דבק בעזרת פיפטה או מכחול. הסרה של עודפי גליצרול עם שאיפה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים פרוסות המוח בשקופית כדי הרצויה עם מכחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית לכסות בעדינות נמוך יותר (24 X 60 מ&quot;מ, חתול. # 48383-139, VWR) על גבי קלטת דבק, נזהרת שלא להכניס בועות אוויר. בעדינות להפעיל לחץ על מכסה זכוכית, כדי להבטיח מגע עם דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב גליצרול עודף קצוות בין שקופיות coverglass. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם שקופיות coverslip באמצעות לק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבוש לפני הדמיה, או לאחסן לטווח ארוך בקופסאות שקופיות ב 4 ° C. </li></ol> 7. נציג תוצאות: עיבוד, הדמיה וניתוח של רקמת המוח שכותרתו fluorescently הפכו הכרחי ללמוד את לנוירוביולוגיה. רבים של חקירות אלה מחייבים מניפולציות גנטיות מתוחכמות כדי להשיג ביטוי הכתב תת עצבי ממוקד, ואחריו שני ניתוחים התמונה נמוכה ברזולוציה גבוהה. לעתים קרובות מגבלות הניסוי הטכני לעשות את זה אי אפשר להשיג סוגים אלה של נתונים חיים זהה, או בצורה מהירה. הכנת אופטית, ניקה, חצי עבה חלקים במוח פלורסנט הדמיה מסייע האתגר הזה. דוגמה פרוסה עבה מוח שלם שכותרתו עם וירוס הכלבת מהונדסים גנטית שהונדסו EGFP, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent ו confocal מוצג באיור 4 ואיור 5 בהתאמה. עבור הדמיה epifluorescent השתמשנו M205 Leica FA, ועל רכישת התמונה confocal השתמשנו LSM Zeiss 510. בשל הפשטות היחסית של בפרוטוקול המצורף, שיטה זו הוא מסוגל מניב נתוני התמונה שימושי מרקמות להביע כתבים ניאון עם זמן אספקה ​​של היום פחות, והוא תואם עם שניהם במיקרוסקופ אור נמוכה ברזולוציה גבוהה. אם החוקר בוחר לשלב שיטות נוספות תיוג שלאחר המוות, מכתים immunohistochemical, או להפוך חלקים רזה, פרוטוקול מתארך בהתאם. עם זאת, בשיטה המתוארת לעיל מייצג שיטה פשוטה יחסית תפוקה גבוהה עבור דפוסי הקרנת הביטוי העיתונאי חיוניים במוח שלם. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים זרימה diagraming את הקיבעון, ביתור, חיתוך, ניקוי, וההליך הרכבה של חצי עבה פרוסות המוח. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. דיאגרמה של צעדים חיתוך רציפים כדי לחלץ את המוח עכבר ללא פגע. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. צעדים הר פרוסה רקמת המוח באמצעות Compresstome. א) המיקום של רקמת המוח על חיתוך הבוכנה באמצעות דבק מגע. ב) ציור מטה רקמת המוח רכוב לתוך הבוכנה להטבעת agarose. ג) לחיזוק תקע המוח agarose באמצעות בלוק דחיסה צונן. ד) החדרת תקע המוח agarose ו הבוכנה לתוך תא חיתוך Compresstome. E) המערך של סכיני הגילוח למכשיר הבוכנה. F) חיתוך אוסף של פרוסות המוח לתוך תא חיץ Compresstome. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. תמונות במיקרוסקופ אור פרוסה עבה של רקמות גליצרול פינו דרך קליפת המוח הקדמית להביע משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (EGFP). פרוסת) העטרה דרך המוח עכבר (200 אממ עבה) שכותרתו עם EGFP וקטור ויראלי להביע הדמיה ברזולוציה נמוכה באמצעות stereoscope epifluorescent. סרגל קנה מידה, 2 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. התמונה בהגדלה גבוהה של שכבת שכותרתו fluorescently 5 / 6 נוירונים בקליפת המוח של פרוסה עבה פינה במוח. א) רזולוציית תמונה גבוהה confocal של הקרנת מקסימום Z-מחסנית (150 אממ עבה) דרך האזור מסומן (איור 4). סרגל קנה מידה, 25 אממ.

<ol>
	<li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Connectome Project. , (2009).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification,+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Jian-Qiang קונג הוא עובד Precisionary מכשירים, Inc, המייצרת מוצר שימוש במאמר זה.

לאור יישום נרחב של חלבונים באמצעות פלורסנט למקד תת נוירונים לחקירה באמצעות מיקרוסקופ אור, הצורך במהירות המסך, תמונה, ולנתח רשתות עצביות בתוך רקמת המוח שלם הפך יסולא בפז. ההתקדמות הטכנית בפיתוח ידידותי למשתמש וקטורים ויראליים, ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; שם הפריט</th&gt;<th&gt; החברה</th&gt;<th&gt; מספר קטלוגי</th&gt;<th&gt; תגובות (אופציונלי)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; עצם מספריים</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt;, או שווה ערך</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; לנתיחה מספריים</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt;, או שווה ערך</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סוג IB agarose</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; מכשירים Precisionary</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt; אחרים, vibratomes תואמים</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; דבק דו צדדי</td&gt;<td&gt; גרייס Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrost פלוס שקופיות</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; כיסוי זכוכית</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גליצרול</td&gt;<td&gt; EMD כימיקלים בע&quot;מ</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt;, או שווה ערך</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

המטרה הבסיסית הן המוח בסיסי וקליני היא להבין טוב יותר את זהויות, איפור מולקולרית, ודפוסי קישוריות האופייניים הנוירונים במוח שניהם בריאים וחולים. לקראת זה, במידה רבה של מאמץ הושם על מבנה ברזולוציה גבוהה מפות neuroanatomical 1-3. עם ההתרחבות של גנטיקה מולקולרית ההתקדמות במיקרוסקופ אור הגיע היכולת השאילתה לא רק מורפולוגיות העצבית, אלא גם את האיפור מולקולרית תאית של נוירונים בודדים ורשתות הקשורים בהם 4. התקדמות גדולה ביכולת לסמן ולטפל הנוירונים באמצעות טכנולוגיות המיקוד ואת מהונדס גנטי מכרסם כעת לאפשר לחוקרים תת נוירונים &quot;התוכנית כרצונו 5-6. ניתן לטעון, אחת התרומות המשפיעים ביותר על בני זמננו מדעי המוח כבר גילוי שיבוט של הגנים המקודדים חלבונים ניאון (fps) ב 7-8 חוליות ימיים, לצד הנדסת הבאים שלהם תשואה הכלים המתרחבת של כתבים חיוני 9. ניצול הספציפיים לסוג תא מקדם פעילות לנהוג ממוקד ביטוי FP באוכלוסיות עצביות נפרדות עכשיו מאפשר חקירה neuroanatomical בדייקנות גנטית. הנדסה ביטוי FP בנוירונים השתפר בהרבה להבנת מבנה המוח ותפקודו. עם זאת, הדמיה נוירונים בודדים ורשתות הקשורים בהם ברקמות המוח עמוק, או בשלושה ממדים, נשאר אתגר. בשל תוכן שומנים גבוהה, רקמת העצבים היא אטומה ולא ותערוכות פלואורסצנציה אוטומטי. מאפיינים אלה biophysical הטמון להקשות לדמיין ותמונה נוירונים שכותרתו fluorescently ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent או confocal תקן מעבר מעמקי עשרות מיקרונים. כדי לעקוף את זה לעתים קרובות החוקרים אתגר להעסיק הדמיה סדרתי סעיף דק שיטות השחזור 10, או 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר 11. חסרונות הנוכחית כדי גישות אלו הם הכנה הקשורים עתירי עבודה רקמות, או עלות אוסרני מכשור בהתאמה. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה יחסית לדמיין תאים שכותרתו fluorescently ב קבוע למחצה עבה פרוסות המוח עכבר ידי ניקוי הדמיה אופטית. בפרוטוקול המצורף אנו מתארים את שיטות: 1) תיקון רקמת המוח באתרו דרך זלוף intracardial, 2) דיסקציה והסרה של המוח כולו, 3) הטבעה המוח נייח agarose, 4) חצי פרוסה עבה דיוק הכנה באמצעות מכשור חדש vibratome , 5) המוח ניקוי רקמות באמצעות צבע גליצרול, ו 6) גובר על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ אור Z-מחסנית שחזור (איור 1). להכנת פרוסות המוח יישמנו יצירה חדשה יחסית של מכשור בשם &quot;Compresstome&quot; VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). מכשיר זה הוא microtome חצי אוטומטיות מצויד מראש ממונע ותנודות מערכת להב עם תכונות דומות פונקציה vibratomes אחרים. בניגוד vibratomes אחרות, רקמת להיות פרוס מותקן בתקע agarose בתוך גליל נירוסטה. הרקמה הנמתח על עובי הרצוי מתוך גליל, וחותכים ידי להב רוטט קדימה לקידום. התוספת agarose / מערכת גליל מאפשר לשחזור רקמות הרכבה, יישור, חיתוך מדויק. בידיים שלנו, &quot;Compresstome&quot; תשואות גבוהות רקמות איכות פרוסות עבור electrophysiology, אימונוהיסטוכימיה, ישיר רקמה קבועה הרכבה והדמיה. בשילוב עם ניקוי אופטית, כאן אנחנו מדגימים הכנת למחצה עבה פרוסות המוח קבוע עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ניאון.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices at JoVE.com

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

a-rapid-approach-to-high-resolution-fluorescence-imaging-semi-thick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Views.  Baylor College of Medicine (BCM). כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

Video: A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...