הפרוטוקול שלנו יקל על חקירה של מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים, מה שחיוני להבנה טובה יותר של תפקודי המוח. טכניקת הסליקה שלנו, ScaleSF מפעילה יכולת ניקוי חזקה, כמו גם רמה גבוהה של שימור רקמות הנדרשת להדמיה סימולטנית של מבנים בקנה מידה גדול וקטן כאחד. הפרוטוקול שלנו יעיל במיוחד במוח שבו תאי עצב מפגינים תהליכים משוכללים, קשרים אדירים ומסדרים מבנים תת-תאיים עדינים מיוחדים.
לפני תחילת הניסוי, הכינו פתרונות Sca/eS כפי שמוצג בטבלה זו וכסו את הדגימות בנייר כסף. התחל את ההליך על ידי הוספת שמונה מיליליטרים כל אחד מתמיסות ScaleS0 ו- ScaleS4 לשתי בארות נפרדות של צלחת תרבית תאים של שש בארות וחמם מראש את הצלחת ל -37 מעלות צלזיוס באינקובטור. מעבירים את פרוסות המוח לתמיסת ScaleS0 שחוממה מראש עם מרית ומדגרים את הפרוסות למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-90 סל"ד.
לאחר מכן, מעבירים את פרוסות המוח המחוררות בשמונה מיליליטרים של PBS מינוס בצלחת תרבית תאים של שישה בארים ושוטפים במשך 15 דקות על ידי שמירה על שייקר מסלולי ב-40 עד 60 סל"ד. חזור על שלב זה פעמיים. לאחר מכן, העבירו את פרוסות המוח לשמונה מיליליטרים של תמיסת ScaleS4 שחוממה מראש ודגרו במשך שמונה עד 12 שעות ב-90 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.
להכנת התא, הדפס בתלת-ממד את מסגרת התא ואת מתאמי שלב המיקרוסקופ. חברו את מסגרת התא לכיסוי באמצעות דבק רגיש ללחץ. הכן 1.5% אגרוז בתמיסת ScaleS4D25(0) .
מערבבים את התמיסה ומחגלים אותה במיקרוגל עד שהאגרוז מומס במלואו. לאחר מכן אפשרו לתמיסה להתקרר ל-37 מעלות צלזיוס. הרכיבו את פרוסת המוח המנוקה על הכיסוי התחתון של תא ההדמיה בעזרת מרית.
הסר את התמיסה העודפת מהפרוסה המנוקה באמצעות רקמה נקייה. הוסיפו את הג'ל ScaleS4 לפרוסת המוח באמצעות מיקרופיפט כדי למלא את תא ההדמיה. מניחים על גבי מכסה נוסף עם מלקחיים ואחריו פיסת נייר טישו ומגלשת זכוכית.
מעבירים את תא ההדמיה למקרר בארבע מעלות צלזיוס. מניחים משקולות מתכת על מגלשת הזכוכית ומשאירים אותן למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, מוציאים את החומר מתא ההדמיה ומנגבים את עודפי הג'ל.
מניחים את תא ההדמיה בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ ומחברים את שפת תא ההדמיה במספר נקודות לצלחת עם דבק רגיש ללחץ. יוצקים את תמיסת ScaleS4 לתוך המנה ומנערים בעדינות במשך שעה אחת ב-40 עד 60 סל"ד ב-20 עד 25 מעלות צלזיוס. החליפו בתמיסה טרייה והסירו בועות אוויר על משטח הג'ל על ידי גירוד עדין של המשטח באמצעות קצה פיפטה.
הרכיבו את תא ההדמיה על במת מיקרוסקופ. הכינו מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה של 2.5 מילימטרים, הגדלה של פי 16 ומפתח צמצם מספרי של 0.60. הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי, כגון תחנת העבודה, המיקרוסקופ, הסורק, הלייזרים, מנורת הכספית והפעל תוכנת הדמיה.
הגדר את צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית מרובת הטבילות ל- 1.47. לטבול את העדשה האובייקטיבית בפתרון ולתת לה להתקרב לפרוסה לאט. הסר את כל בועות האוויר הלכודות בקצה העדשה האובייקטיבית.
מצא אזורים בעלי עניין ברקמות מנוקות באמצעות אפיפלואורסצנציה. כדי להגדיר פרמטרים של רכישת תמונה, ראשית, קבע את עומק הסיביות לרכישת תמונה ככל שגודל התמונה גדל עם הסיבית. לאחר מכן הגדר את אורך הגל של הגילוי בהתאם לספקטרום הפליטה.
הגדר את רזולוציית XY, מהירות הסריקה וגודל חור הסיכה. כמו כן, התאם את כוח הלייזר, את הגדלת מגבר הגלאי והסט עד לקבלת תמונה מתאימה. קבעו את גודל הריצוף בהתבסס על גודל ההחזר על ההשקעה, והבטיחו שכל האורך והרוחב של ההחזר על ההשקעה יילכדו.
נווט דרך הרקמה בכל המישורים והגדר את נקודות ההתחלה והסיום של הערימה. הגדר את גודל הצעד Z, בהתאם לרזולוציית Z הרצויה. אסוף את התמונות ועבד אותן באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
באמצעות פרוטוקול זה הושג ניקוי אופטי של פרוסת מוח של עכבר בעובי של מילימטר אחד. ביטוי EGFP בקליפת המוח של עכברי PV-FGL הראה כי הפלואורסצנציה והשלמות המבנית של הרקמות נשמרו. אי-התאמה של מקדם שבירה שגרמה לסטיות שנגרמו כתוצאה מאובדן ניכר של בהירות התמונה והרזולוציה של נוירונים חיוביים של EGFP.
נוירונים אלה הודגמו בבירור באמצעות מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי כאשר צווארון התיקון הותאם כך שיתאים לפתרון ScaleS4 זה. שחזור תלת-ממדי של תאי עצב המסומנים על-ידי EGFP בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של העכבר נעשה בפרוסת מוח בעובי של מילימטר אחד. ארבורים דנדריטיים בודדים המעוטרים בקוצים דנדריטיים נראו בהגדלה גבוהה יותר.
כמו כן נצפו בפרוסות ארבוריזציה של מסוף אקסון ובוטונים אקסונאליים. התאמת אינדקס רפלקטיבי בין נוזל הדמיה לעדשת אובייקט היא קריטית להדמיה תלת-ממדית ברקמות מנוקות. הטכניקה שלנו תקל על שילוב מבנה הנוירונים מקנה מידה של מעגל לרכיבים, ותספק תובנות על מנגנוני נוירונים, מידע על עיבוד במוח.
