העבודה נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Core המחקר, HEI. התוכן שלה הוא אך ורק באחריות הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של NIH או HEI. המחברים מצהירים שום סכסוך קיימים או פוטנציאליים של עניין.

1. בידוד של OHCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הליך זה על ידי קצירת עצמות הזמני של שרקנים, עכברים או מודל בבעלי חיים יונקים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לפתוח את עצמות הזמני באמצעות ניפר המכשפות על מנת לחשוף את השבלול, וכן לטבול אותם ליבוביץ L-15. הסרת עודף עצם בזהירות, תוך שמירה על מעטפת גרמית ללא פגע. בעוד שמדובר בהליך הכללי החלים על עצמות הזמני של כל מיני יונקים, שינויים קלים הטכניקה ייתכן שיהיה צורך בהתמודדות עם עצמות הזמני מבעלי חיים קטנים מאוד. אצל בעלי חיים בן בולה הוא מסויד בדרך כלל, מציגה סיבוך נוסף להליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תצפית Microscopical, לפתוח את האזור apical של שבלול ולהסיר vascularis stria והרצועות ספירלה באמצעות קצה של להב # 11 אזמל, נקודת מיקרו לקטוף פינצטה בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את איבר קורטי מן כישור שבלול באמצעות פינצטה, ושמתי אותו collagenase 1mg/ml ב-L-15 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם OHCs מתוך הופך הבסיס של שבלול יש צורך, להסיר את הקליפה גרמית המכסה את הבסיס של שבלול עם לבחור את, ולהפריד את הספירלה של העצם הטמפורלית באמצעות להב סכין המנתחים לפני הסרת איברים של קורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת איברים של קורטי לתא הקלטה באמצעות מזרק 50 μL המילטון. לאחר מכן לנתק את התאים על ידי ריפלוקס דרך המחט. </li></ol> 2. ניסיוני ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרשים של גנרטור חשמלי חיצוני לסירוגין שדה (EAEF) ואת הקישורים שלהם עם מערכת ללכוד תמונה (איור 1). מעגלי הבקרה בוצעה במיוחד בבסיס הנדסה של האוזן בית המכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הניסוי נעשה שימוש בניסויים שלנו מורכב מיקרוסקופ Axiovert הפוכה 135TV (Zeiss, Thornwood, ניו יורק) עם מערכת מבוססי LED חלופה תאורה (הספק גבוה LED System-36AD3500, לייטספיד טכנולוגיות, קמפבל, CA), שני micromanipulators אלקטרוניים (Eppendorf &quot;Patchman&quot;, גרמניה), מחשב שבשליטת גבוהה במיוחד מהירות Photron Fastcam X 1024 PCI המצלמה (Photron ארה&quot;ב Inc) בנמל קלר מצלמת CCD נוסף קבוע בנמל trinocular. המצלמה Fastcam מסוגל ללכוד תמונות בתדרים גבוהים (עד 100.000 fps) ברזולוציה גבוהה (למשל, 1024 x 1024 פיקסלים על 1000 fps, 512 x 128 ב 10,000 fps, 384 x 96 ב 18,000 fps, וכן הלאה). התמונות שמספקת המצלמה במהירות גבוהה הם נצפו ישירות לצג המחשב, בעוד מצלמה CCD מחובר צג שונים. מערכת תאורה מבוססי LED עובד בשני מצבים שונים: צריכת חשמל נמוכה אנלוגי הספק גבוה דיגיטלית. כל הנהלים ראשוני (מיקום האלקטרודות, מיקום התא, פוקוס, וכו &#39;) מבוצעים באמצעות מצב צריכת חשמל נמוכה אנלוגי. תאורה כוח גבוהה מופעל על ידי הצמצם של תריס המצלמה ואז כיבה ידי סגירת תריס, בהנחיית פיזור חום. תוכנה תוצרת בית, שפותחה גם על האוזן Core בית הנדסה המכון, פועל על אותו המחשב שולט על ההדק של המצלמה במהירות גבוהה, מערכת תאורה מבוססי LED, ואת EAEF. מצלמה קונבנציונאלי תמונה דיגיטלית בנמל מול מאפשר עדיין מסגרות לפי הצורך. (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות (שני 0.25 מ&quot;מ בקוטר החוטים Ag עם המרחק קצה 0.8 מ&quot;מ) מונעים לתפקיד באחת micromanipulators אלקטרוניים. עמדת אלקטרודות מנוטר ויזואלית באמצעות תמונה מיקרוסקופית, שינוי במישור המוקד של התמונה עולה כי האלקטרודות נגע בתחתית תא הניסוי. בתחילה, השדה החשמלי הוא מכויל באמצעות אלקטרודה חיצונית. אלקטרודה זו מודדת את הפוטנציאל החשמלי בנקודות שונות, יצירת &quot;מפה&quot; של שדה חשמלי. אם תא בודד ומבודד השיער החיצוני ממוקם בין קצות האלקטרודות עם מקביל לציר האורך שלה EAEF מיושם, זה יהיה מהלך מתארך וקיצור באותה התדירות של השדה החשמלי. אם התא ממוקם בניצב לשדה מסוג אחר OHC תגובה (כיפוף) ניתן להבחין וחקר. (איור 2 ב &#39;) </li></ol> 3. EAEF גירויים לכידת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה פרוטוקולים גירוי שונים לבחירה (איור 3): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדר אחד רציף (איור 3). שימו לב לסוג מצב גירוי, תדירות, משרעת הגל ניתן לבחור באמצעות תוצרת בית תוכנה מלאה (עיגולים אדומים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדר בודד bursted (איור 3 ב). אורכו של התפרצויות הפערים בין פרץ גם הם לבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטאטא ליניארי (איור 3 ג). תדרים התחלתי וסופי הם לבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רב גירוי (איור 3 ד &#39;). תדר יחיד וסוחף ליניארי ניתן לשלב בניסוי יחיד. לאחר בחירת הפרמטרים המתאימים, תוכנת בקרת התצורה של המערכת מאפשרת למפעיל ליזום אור מסונכרן הקלטת וידאו גירוי התא ידי לחיצה על לחצן יחידאת מסך המחשב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות נלכדים בפורמט AVI לניתוח נוסף בתדרים גבוהים. </li></ol> 4. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרט זה, שני תאים מבודדים השיער החיצונית להראות שינויים באורך או עקמומיות כאשר הם מקבלים גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין כי הוא מקביל או משוכל, בהתאמה, על ציר האורך שלהם. (סרט # 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובות OHCs ניעתי מנותחים off-line באמצעות תוכנת ProAnalyst (Xcitex Inc, Cambridge, MA). &quot;מעקב תכונה&quot; לתפקד תוכנה זו מספקת את המרחק בין שתי נקודות מסגרת לפי מסגרת (איור 4). במהלך תא לקצר את המרחק בין נקודות שנבחרו (צלחת Cuticular; צבע אדום) שיא ובסיס של התא (מוט בסל; צבע ירוק) הוא קטן יותר, עולה עם התארכות התא. הסרט מראה את תוכנת ניתוח מסגרת לפי מסגרת השינויים באורך. הפאנל בתחתית התמונה מראה את עקבות של התנועה. בדוגמה זו, הכוללת את השינוי באורך כ 6.5 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;קונטור מעקב&quot; פונקציה בתוכנה ProAnalyst יכול לזהות קצה סלולריים באופן אוטומטי למדוד את השטח של החלק האופטי (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליסטירן microspheres הוסיף לפתרון אמבטיה באקראי בתוקף לצרף הממברנה פלזמה (איור 6). Microspheres שונים ניתן לבחור בו זמנית, התוכנה יכולה לעקוב באופן אוטומטי אחר כל אחד מהם תמונה אחר תמונה. בדרך זו, התאים מתחלקים בחלקים ועל תנועתיות של כל מקטע הוערכו באופן עצמאי. (איור 6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי בחירה microspheres ממוקמת בשולי התמונה לרוחב של התא, שינויים באורך של כל פלח ושינוי זווית של כבוד קטע אחד על השני (כיפוף) יכול גם להעריך באופן עצמאי. (איור 6 ב) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. דיאגרמה של הגנרטור EAEF ואת הקישורים שלהם עם מערכת לכידת תמונה. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="איור 2"/> 2. איור תמונה) של הגדרת הניסוי. ב) פירוט של השלב מיקרוסקופ, עם הקריקטורות האלקטרודות לבין OHC יחיד להציב ביניהם עם ציר האורך שלו מקביל לשדה החשמלי. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ממשק המשתמש) של התוכנה לשלוט תוצרת בית מוגדר גירוי יחיד בתדר. הפרמטרים שנבחרו בעיגול אדום. ב) ממשק המשתמש של התוכנה תוצרת בית שליטה מוגדר גירוי פרץ יחיד בתדר. ג) ממשק משתמש של תוכנה תוצרת בית שליטה מוגדרת לגירוי לטאטא לינארי. ד) ממשק משתמש של התוכנה לשלוט תוצרת בית מוגדר גירוי רב. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. בודד של OHC עם שתי נקודות שנבחר בבסיס (ירוק) לבין איפקס (אדום) של התא, בהתאמה, באמצעות &quot;מעקב תכונה&quot; פונקציה של התוכנה ProAnalyst. עקומת מתחת לתא מראה את השינויים התקופתיים של המרחק בין נקודות נבחרים הקשורים גירוי חשמלי. הזזת פס אנכי מסגרות שונות ניתן לבחור לניתוח בודדים. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. &quot;מעקב קונטור&quot; לתפקד ProAnalyst מזהה את קצה סלולריים באופן אוטומטי למדוד את השטח של החלק האופטי. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. Image) של שבויים OHC מבודדים מעוטרים פוליסטירן microspheres (למעלה), ואת אותה התמונה עם חמישה microspheres נבחרים בנפרד (התחתון). צבע שונה הוצב microsphere כל אחד, התקות שלהם יכול להיות בנפרד באופן אוטומטי על ידי מעקב אחר מסגרת מסגרת, ניתחו והשוו. ב) קטעים באורך שרירותי ניתן להגדיר על ידי בחירת פוליסטירן microspheres ממוקם בשולי התא, שינויים באורך של מגזרים אלה, כמו גם שינויים בכיוון של כבוד קטע אחד לאחרים (תא כיפוף) ניתן להעריך באופן אוטומטי על ידי מסגרת מסגרת עם תוכנת עיבוד תמונה. סרט 1. בידוד OHCs קביה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a> סרט 2. OHCs מקבילים בניצב EAEF מראה אופייני electromotility ותגובות כיפוף. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a>

<ol>
	<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells.">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+motility.">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li><li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin,+a+new+type+of+motor+protein.">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field.">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells.">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells.">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+cochlear+amplifier.">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li><li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field.">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li><li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+outer+hair+cell+motility:+corrections+and+addendum.">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li><li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells.">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility:+effects+of+the+membrane+filter.">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy. , (1986).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת הניסוי המוצג כאן מאפשר לאמוד תגובות OHC ניעתי בטווח kHz ללא הגבלה כלשהי לתנועה של התא. פרוטוקולים שונים של גירוי, סמנים נוספים (microspheres), כמו גם שינויים בכיוון של התא ביחס השדה החשמלי, מאפשרים לחקור היבטים חדשים של תנועתיות OHC עם רמת הפירוט נגישים קודם לכן. שיטות אחרות...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> ליבוביץ L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase (סוג 4) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C5138 </td><td> 1mg/mL ב-L-15 </td></tr></tbody></table>

investigating outer hair cell motility with a combination of external alternating electrical field stimulation and high-speed image analysis

OHCs הם גלילי תאים הסנסורית ממוקם האיבר של קורטי, איבר השמיעה בתוך האוזן הפנימית יונקים. השם &quot;תאים שיער&quot; נובעת צרור apical האופיינית שלהם stereocilia, אלמנט קריטי עבור איתור התמרה של אנרגיה צליל 1. OHCs מסוגלים לשנות צורה, להאריך, לקצר, לכופף בתגובה גירוי חשמלי, מכני כימי, תגובת המנוע נחשב חיוני שבלול הגברה של אותות אקוסטיים 2. הגירוי גורם OHC ניעתי שתי תגובות שונות: i) electromotility, תנועתיות מהירה aka, שינויים באורך בטווח המיקרו נגזר חשמלית המונעת שינויים קונפורמציה בחלבונים מנוע בצפיפות בקרום פלזמה OHC, ו ב) תנועתיות איטית, משנה את צורתו ב אלפית שנייה כדי שניות טווח מעורבים מחדש cytoskeletal 2, 3. OHC כיפוף קשורה electromotility, והתוצאה גם מהפצת אסימטרית של חלבונים מנוע בקרום פלזמה לרוחב, או גירוי חשמלי אסימטרית של חלבונים אלה המנוע (למשל, עם שדה חשמלי הניצב לציר הארוך של התאים) 4. גירויים מכניים וכימיים לעורר תגובות ניעתי איטי בעיקרו, למרות שינויים בתנאי יוניים של תאים ו / או בסביבה שלהם יכול גם לעורר את הפלזמה קרום מוטבע מנוע חלבונים 5, 6. מאז התגובות OHC ניעתי הם מרכיב חיוני של המגבר שבלול, ניתוח איכותי וכמותי של התגובות הללו ניעתי בתדרים אקוסטי (בערך מ - הרץ 20-20 קילוהרץ בבני אדם) היא עניין חשוב מאוד בתחום של שמיעה המחקר 7. הפיתוח של טכנולוגיית הדמיה חדש המשלב מהירות גבוהה במצלמות וידאו, מערכות מבוססות LED תאורה, תוכנה מתוחכמת ניתוח התמונה עכשיו מספק את היכולת לבצע איכותי ואמין מחקרים כמותיים התגובה ניעתי של OHCs מבודד לשדה חשמלי חיצוני לסירוגין (EAEF) 8. זוהי טכניקה פשוטה ולא פולשנית אשר עוקף את רוב המגבלות של הגישות הקודמות 9-11. יתר על כן, מערכת תאורה מבוססי LED מספק בהירות קיצוני עם אפקטים תרמיים מבוטל על דגימות, ובשל השימוש במיקרוסקופ וידאו, רזולוציה אופטית הוא לפחות פי 10 יותר מאשר עם טכניקות קונבנציונאלי מיקרוסקופ אור 12. למשל, עם הגדרת הניסוי המתואר כאן, שינוי אורך התא של כ -20 ננומטר יכול להיות שגרתי זוהה באופן מהימן בתדירויות של 10 קילוהרץ, ועל החלטה זו ניתן לשפר עוד יותר בתדרים נמוכים. אנו בטוחים כי זו גישה ניסויית יסייע להרחיב את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסלולר תנועתיות OHC.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis at JoVE.com

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  House Ear Institute. שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

Video: Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

ממשק אדם-מכונה-שילוב חיישנים בעלות נמוכה עם מערכת גירוי חשמלי Neuromuscular לשיקום מאזן פעימות הודעה

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

הערכה של תפקוד העצבי באמצעות גירוי עצבי חשמלי Percutaneous

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

הדמיה וידאו ומפות Spatiotemporal לנתח תנועתיות מערכת העיכול של עכברים

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

ההשפעות של גירוי זרם חילופין טראנס על קליפת המוח המוטורית הראשי על-ידי גישה משולבת מקוון עם גירוי מגנטי טראנס

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

טראנס גירוי חשמלי מוחי בחולדות התראה

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...