המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Gongpu ג&#39;או Danxia Ke לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים בני הזוג. אדוארד Egelman וניקו Grigorieff לשיתוף תוכנת עיבוד התמונה שלהם. אנחנו גם מכירים את הצוות התומכים לביולוגיה מבנית cryo-EM מתקן אשכול Beowulf ורשת באוניברסיטת פיטסבורג הספר לרפואה. עבודה זו נתמכה על ידי GM082251 ו GM085043.

1. Frozen-EM hydrated הכנת הדגימה בגלל HIV-1 חלבון capsid (CA) מכלולים 9 יציבים רק מלח חיץ גבוה (1M NaCl), אשר תורמת רעש רקע חזק cryo-EM תמונות, אנו משתמשים דילול מהירה וחזרה בצד שיטה סופג transiently כדי להפחית את המלח הריכוז בעת הכנת רשת קפוא hydrated EM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריקה זוהר הצד הפחמן של R2-200 רשת / 1 רשתות נחושת Quantifoil תחת 25mA עבור 25 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש nebulizer להביא את הלחות בחדר הסביבה, תוצרת בית הכבידה הבוכנה ידנית, עד 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב Vitrobot פיי הבוכנה דיואר, אתאן נוזלי מגניב באמצעות חנקן נוזלי. הר לצלול מקפיא דיואר על הבוכנה את חומרת ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 2.5 μl של פתרון CA preassembled על הצד פחמן של הרשת, שהוא רכוב על מלקחיים, ו לטעון את מלקחיים על הבוכנה עם הצד פחמן של הרשת מול ממך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של חיץ דילול נמוך מלח (100 mM NaCl) לצד האחורי של הרשת ומיד למחוק את הצד האחורי של הרשת עם פיסת נייר הסינון. המשטח האחורי שלם של הרשת צריך להיות בקשר הדוק עם נייר סינון במשך כ 6 שניות, לפני הסרת הנייר הסינון. מיד לצלול לתוך הרשת אתאן נוזלי לאחר הסרת נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מלקחיים מן הבוכנה ובמהירות להעביר את הרשת לתוך קופסת אחסון רשת. </li></ol> 2. Cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית של CA צינורי אסיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את רשת קפוא hydrated תוך הפעלה Polara פיי מיקרוסקופ אלקטרונים G2 ב 200kv מצויד במצלמת CCD 4Kx4K Gatan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, חיפוש, בהגדלה של ~ 200x עם מנה &lt;0.001e - / 2, מסך כל רשת עבור אזורים עם קרח מתאים ולהציל את עמדות באזורים אלה בקובץ הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזכיר את העמדות נשמר מסך נוסף באזורים אלו בהגדלה של 3900 x במצב במינון נמוך החיפוש. בחר את האזורים בשכבה, אחידה דקה של קרח המכיל היטב מופרדים, צינורות ארוכים יותר חורים, לצורך איסוף נתונים. שמור את מיקומם של אזורים אלה בקובץ השלב השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב חשיפה בהגדלה של 59,000 x, הבלעה 100 מיקרומטר אובייקטיבי הצמצם, ולהתאים את stigmatism אובייקטיבי עוצמת קרן מנה של ~ 15 דואר - A / 2 לכל חשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזרה למצב במינון נמוך, חיפוש, לעבור מעמדה הציל ולזהות מרכז שפופרת טוב באמצעות מצלמה CCD. מעבר למצב המוקד, להתאים את להתמקד, להגדיר ערך defocus, בדרך כלל בין 0.5-2.5 מיקרומטר. מעבר למצב את החשיפה, להגדיר זמן החשיפה של 0.3-0.5 שניות, במינון של ה 15 - / 2, ולאסוף תמונה. התמונות נאספות על המצלמה צלחת, והסרטים צריך להיות מותר להתיישב למשך 10 שניות לפני החשיפה היא נלקחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לתפקיד הציל הבא וחזור על שלב 5 כדי לאסוף תמונות ועוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרטים מפותחים במלוא העוצמה D19 במשך 12 דקות דיגיטציה באמצעות סופר coolscan סורק ניקון 9000 ED בגודל פיקסל של 6.35 מיקרומטר. הפורמט של קבצי התמונה TIFF. </li></ol> 3. הסליל לאינדקס חפץ הסליל יכול להיות באינדקס של שני פרמטרים: סדר בסל, n, קו שכבה מספר, אני. כל שורה שכבה של התמרת פורייה, המאופיינת על ידי (n, l), מתאים לקבוצה של קווים על הסריג פני השטח של האובייקט מצוין על ידי הסליל (ח, יא) המדדים, תוך שימוש בסימון של סריג 2D. עבור כל (ח, יא), שורה (n hk, אני HK) שכבת צירוף ליניארי של שני וקטורים בסיסיים (n 10, אני 10) ו - (n 01, אני 01), המהווים את n ואני ערכי שני קווי שכבת העיקרי (1, 0) ו - (0, 1). l ניתן לקבל גובה שכבת קו נמדדת לאורך ציר Z ב התמרת פורייה. הערך של n ניתן לאמוד באמצעות המשוואה הבאה 10 πRr ≈ ≈ 1.1 J n | n | -0.9 .....................( 1) איפה J n הוא פונקציה בסל, הקובעת את עוצמת הקו שכבת ה n, r הוא רדיוס הסליל של האובייקט, ו R הוא רדיוס של משרעת המקסימלי של קו השכבה. קו השכבה מספר, אני, קשורה n על ידי כלל הבחירה 11 l = TN + אממ ....................( 2) איפה t ו u הם קבועים של הסליל. עבור סליל נתון, ייתכן שיש יחידות u בדיוק בדיוק (או מאוד מקרוב) לא גomplete פונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת החוצה צינור ישר יחסית ארוך בקוטר אחיד באמצעות 12 תוכנית של אימאן helixboxer ולשמור את התמונה בפורמט MRC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את המרחק לחזור על הסליל, ג, באמצעות תוכנית צולבות המתאם מבוסס, כגון &#39;imgccf &quot;, בחבילה MRC 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את התמרת פורייה עם אורך תיבה חדשה אינטגרלי המרחק חוזר, ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שתי שורות שכבת העיקרי להגדיר שני בסיסי סריג משטח וקטורים (1,0) ו (0,1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הרדיוס של הצינורית, r, ואת גובה רדיוס של שני הקווים השכבה העיקרית התמרת, אני 10, R 10, אני 01 R 01, בהתאמה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב n 10 ו n 01 לפי משוואה (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז ערכי n הם רק הערכה, שילובים כמה n 10 ו n 01 נבדקים צעדים מאוחר יותר (ראה שלב 4.2) כדי למצוא את הסימטריה הנכונה הסליל באמצעות IHRSR חבילת התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הסימטריה הבורג המתואר על ידי שני מספרים ממשיים: הרוטציה בין יחידות משנה (Δφ) ועליית צירית (Δz) של הסליל כוכב אחד (n = 1). בהתחשב l 10, אני 01, 10 n, ו n 01 ערכים, u ו t ניתן להשיג על ידי בדיקות טווח ערכים מ (למשל, -50 &lt;מ &lt;50) על פי חוק הבחירה. לבסוף, Δφ ו Δz מחושבים באמצעות Δφ t = 360 / u ו Δz = c / u. </li></ol> 4. שחזור תלת ממדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלקיקים פילוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח מיקרוסקופ המכיל חלקיקים הסליל, באמצעות תוכנית בוקסר גרפי, שהיא תוכנית בחבילה נאמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלקיקים הסליל למקטעים חופפים. בלוח הבקרה של בוקסר, לבחור מצב הסליל וכן להגדיר את הפרמטרים עבור אגרוף: גודל התיבה צריך להיות גדול יותר מאשר קוטר של החלקיקים ואת הערך עבור &quot;OLAP&quot; יש ~ 90% של גודל התיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השמאלי לחיצה על הקצוות של החלקיקים הסליל, בוקסר באופן אוטומטי ליצור סדרה של תיבות החלקיקים לאורך סליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור קטעי התאגרף, כמו גם את הקואורדינטות שלהן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור 3D ראשוני באמצעות תוכניות IHRSR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החדות של התמונות cryo-EM וליישם לעבור סינון נמוך 14 (אופציונלי) לפני עיבוד עם איטרטיבי הסליל שיטת שחזור אמיתי בחלל (IHRSR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הממשק הגרפי של תוכנית IHRSR ידי הקלדת &quot;מחולל&quot;. ספק את הממשק הגרפי עם כל המידע עבור מחסנית חלקיקים התאגרף, כולל שם ונתיב של מחסנית, מספר התמונות בערימה, את הערכים עבור הפרמטרים סימטריה, וכו &#39;לחץ על הכפתור &quot;סיום&quot; כדי ליצור את התסריט מחדש, b25.spi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גליל מוצק או חלול כנקודת התייחסות ראשונית ולאפשר את ההליך מחזור עד אין שינויים סימטריה את הבורג מוגדר, אשר מתרחשת בדרך כלל לאחר מספר מחזורים. סימטריה זכות הסליל צריך לתת שחזור ביציבות התכנסו. שחזור שנוצר במחזור האחרון ישמש כנקודת התייחסות ראשונית עבור חידוד נוסף. IHRSR מבצע שחזור 3D באמצעות תוכניות SPIDER. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור עם עידון איטרטיבי 15 שחזור 3D שנוצר על ידי IHRSR משמש כיום כנקודת התייחסות ראשונית עבור חידוד נוסף. במהלך עידון, הסימטריה הסליל הוא קבוע Δφ ו Δz, הנקבעים מההליך IHRSR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את defocus ובהווה אסטיגמציה ב מיקרוסקופ באמצעות תוכניות CTFFIND3 ו CTFTILT 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל מגזרים החלקיקים ידי CTF באמצעות תוכניות SPIDER 17. המבצע FT כינה את חבילת SPIDER משמש כדי לחשב את התמרת פורייה (FFT) של התמונה 2D. לאחר מכן, FFT הוא מוכפל ערכים CTF, שנקבע על השלבים הקודמים, באמצעות פעולת המכונה MU בתוך הסוויטה SPIDER. הערך המתקבל הוא הפוך אז שינו בחזרה כדי ליצור תמונה חדשה (CTF-מתוקן) במרחב האמיתי באמצעות פעולת SPIDER, FT שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התאמה השלכה על ידי השוואת התחזיות כרכים התייחסות עם CTF-תיקנה תמונות, שימוש רב התייחסות יישור. וריאציה בזווית מחוץ למטוס להטות מוגבל + / -10 ° ו שנדגמו 1 צעדים מעלות. הציגו אילוצים, כגון מקדמי מתאם גבוה, מטוס זוויות ליד 0 ° או 180 °, ו-x מוגבל משמרות, עבור הפרמטרים יישור של כל פלח. כלול בשחזור רק אלה מגזרים המקיימים את האילוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל מחזור איטרטיבי חידוד, שחזור 3D שנוצר באמצעות השלכה לאחור מחולק סכום מעל CTF2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטיל את הסימטריה הסליל כדי ליצור נפח symmetrized. עידון איטרטיבי מסתיימת כאשר אין שיפור נוסף בהחלטת השחזור 3D חדשה מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד התמונה SPIDER חבילת משמש את רוב הצעדים עידון. סדרה של פעולות נשלטים על ידי סקריפטים SPIDER, אשר יצר בקרה למשתמש אצווה קבצים המכילים רצפים של פעולות ערכי פרמטרים. השיקום הסופי מחושב באמצעות תוכניות SPIDER הסוויטה. </li></ol></li></ol> 5. נציג תוצאות: אחד HIV-1 CA A92E שפופרת (איור 1 א) היה מחוץ התאגרף התמרת פורייה שלה (איור 1b) היה מחושב עבור לאינדקס הסליל. עבור קווי שכבת (1, 0) ו - (0, 1), אני 10 = 28, אני 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. בהינתן רדיוס הצינור של 211.57Å, אנו מקורב 10 n =- 12, 01 n = 11 (כאן, handedness היה קבוע מראש). עם מרחק שידור חוזר של 5195.48Å, הסימטריה הבורג של הצינור נקבעה Δz = 6.8093Å, Δφ = 328.88 מעלות. Δz ו Δφ היו מעודן 7.1321Å ו 328.86 ° באמצעות IHRSR (איור 2 א) ו השיקום הראשוני מוצג באיור. 2b. שחזור הגמר (איור 3), אחרי איטרטיבי עידון, שיפרה את מפת צפיפות משמעותית מן הדגם הראשוני מחושב עם IHRSR (איור 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Indexing של הצינור HIV-1 הסליל CA. (א) יחיד HIV-1 CA תמונה A92E צינור. סרגל קנה מידה, 30 ננומטר. (ב) להפוך פורייה של הצינור שמוצג (A). המדדים הסליל (10 n =- 12, 01 n = 11) מסומנים. ראש החץ מצביע על קו שכבת ברזולוציה 23 א. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. השחזור הראשונית באמצעות IHRSR. (א) סימטריה בורג להגדרה עבור כל מחזור איטרטיבי. Δφ ו Δz, החל הערכים ההתחלתיים, להתכנס הערכים יציבה לאחר 10 מחזורים איטרטיבי עידון. (ב) המפה הראשונית צפיפות 3D אחרי 10 מחזורים איטרטיבי. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מפת צפיפות 3D אחרי עידון איטרטיבי. (AC) מפת צפיפות CA צינורות מוצג שלוש פרוסות אורתוגונליים: מקביל לציר הצינור קרוב לפני השטח (A), בניצב לציר הצינור (ב), ובמקביל ודרך ציר הצינור (C) . סולם ברים, 10 ננומטר. (ד) עיבוד פני השטח של מפת הצפיפות בקווי מתאר 3D ב 1.8s התוחם נפח 100%.

<ol>
	<li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice.">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern.">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li><li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist.">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li><li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+model+of+the+microtubule.">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li><li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing.">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li><li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein.">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li><li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella.">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li><li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function.">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li><li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction.">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li><li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+electron+cryo-microscopy:+towards+atomic+resolution.">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li><li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state.">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים קבוצה של פרוטוקולים כדי לספק גישה פשוטה להשיג מבנים 3D של אובייקטים הסליל. שימוש בהליכים שתוארו, רכשנו מבנה 3D של הרכבה-HIV-1 capsid מהתמונה צינור יחיד (176 חלקים). מבנים ברזולוציה גבוהה יכולה להיות מושגת על ידי הכללת נתוני התמונה יותר. ישנן כמה נקודות קריטיות עבור איסוף נתונים ניתוח אופטימלית: ראשית, במהלך הכנת הדגימה cryo-EM, הפתרון צריך להיות מדגם מחק משם, משאיר שכבה אחידה, דקה של הפתרון הזה הוא מעט עבה יותר גודל המדגם. ישנן דרכים שונות למחוק את המדגם. עבור תאים חיידקיים דגימות צינורי, כגון HIV-1 CA הרכבה, סופג מצד אחד, במיוחד בצד הגב, הוא המתאים ביותר. שנית, handedness של הסליל צריך להיות נחוש, כמו זה לא יכול להיעשות על ידי אינדקס שחזור או הסליל. מנהג נפוץ הוא להשתמש להקפיא תחריט, ואחריו רוטרי הצללה 18 כדי לקבוע handedness. Handedness ניתן גם נקבע שלאחר השחזור כאשר הרזולוציה של המפה צפיפות גבוהה מספיק; הדגמים אטומי 3D של רכיבים בודדים צריכה להתאים היטב במפת צפיפות כאשר handedness נכונה ההנחה. אחרת, handedness ההפך יש להניח. שלישית, מסנן וינר אמור לשמש במהלך עיבוד תמונה, לשלב והן תיקון משרעת, כדי להפחית את רעש הגברה. מאז CTF מתוך תמונה אחת תמיד יש אפס המעברים, חלק מן המידע בחלל הגומלין הולך לאיבוד. לכן, זה הכרחי כדי לקבל נתונים הקרנה מרובות קובע כלל עבור 3D שיקום, כל הדמיה בערכים defocus שונים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> מקור </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> זוהר פריקה המכשיר 100x </td><td> זוהר פריקה המכשיר 100x </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 מיקרוסקופ עם אקדח פליטת שדה </td><td> פיי, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan x 4K 4K מצלמת CCD </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> לצלול מקפיא התקן </td><td></td><td> בית מתוצרת הכבידה ידני הבוכנה </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 holely פחמן רשת רשתות נחושת </td><td> Quantifoil מיקרו כלים, Jena, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> EM תוכנה אימאן </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM תוכנה IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> זמין אדוארד ח Egelman התוכניות </td></tr><tr><td> EM תוכנה Spider </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC מבוסס הסליל תוכנת עיבוד </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> זמין מ קוג&#39;י Yonekura התוכניות </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT אמת מרחב תוכנה הסליל עידון </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM), בשילוב עם עיבוד תמונה, היא כלי רב עוצמה יותר ויותר להגדרה של מבנה חלבון מתחמי macromolecular והרכבות. למעשה, חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים 1 ו דו ממדי (2D) קריסטלוגרפיה אלקטרון 2 הפכו מתודולוגיות שגרתי יחסית מספר גדול של מבנים נפתרו באמצעות שיטות אלה. במקביל, עיבוד תמונה תלת מימדי (3D) שחזור של אובייקטים הסליל התפתחה במהירות, בעיקר, איטרטיבי הסליל מרחב אמת שחזור (IHRSR) שיטה 3, אשר משתמשת יחיד כלי ניתוח החלקיקים בשיתוף עם סימטריה הסליל. גורמים ביולוגיים רבים לתפקד בצורות פילמנטיות או הסליל, ובהם סיבי אקטין 4, 5 microtubules, סיבי עמילואיד 6, 7 פסיפס טבק וירוסים, חיידקים שוטונים 8, וכן, כי מפת צפיפות 3D של ישות הסליל ניתן להשיג מ - הקרנה אחת התמונה, לעומת תמונות רבות נדרש שחזור 3D של אובייקט שאינו הסליל, עם שיטת IHRSR, ניתוח מבניות של אסיפות כאלה הסליל גמישה סדר היום השגה. במאמר זה וידאו, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לקבלת מפת צפיפות 3D של הרכבה חלבון הסליל (HIV-1 הוא capsid 9 בדוגמה שלנו), כולל פרוטוקולים להכנת cryo-EM הדגימה, איסוף נתונים על ידי מינון נמוך cryo-EM, אינדוקס דפוסי עקיפה הסליל, ועיבוד תמונה ושיקום באמצעות 3D IHRSR. לעומת טכניקות אחרות, cryo-EM מציע לשימור הדגימה האופטימלי בתנאים יליד הקרוב. דוגמאות המוטבעות בשכבה דקה של קרח זגוגי, על ידי הקפאה מהירה, צילמו ב המיקרוסקופים האלקטרונים בטמפרטורת חנקן נוזלי, בתנאים במינון נמוך כדי למזער את נזק הקרינה. תמונות לדוגמה מתקבלים בתנאים יליד ליד על חשבון אות נמוך ניגודיות נמוכה ב micrographs מוקלט. למרבה המזל, בתהליך של שיקום הסליל יש במידה רבה אוטומטיות, למעט לאינדקס דפוס עקיפה הסליל. כאן אנו מתארים גישה מבנה הסליל מדד ולקבוע הסימטריות הסליל (הסליל פרמטרים) מתוך micrographs דיגיטציה, צעד חיוני עבור 3D הסליל מחדש. בקצרה, אנו מקבלים המפה הראשונית צפיפות 3D באמצעות יישום שיטת IHRSR. מפה זו היא ראשונית ולאחר מכן מזוקק iteratively ידי החדרת אילוצים עבור הפרמטרים יישור של כל פלח, ובכך השליטה שלהם מעלות של חופש. שיפור נוסף מושג על ידי תיקון לתפקוד לעומת העברה (CTF) של מיקרוסקופ אלקטרונים (תיקון המשרעת והפאזה) וכן על ידי אופטימיזציה של סימטריה הסליל של האסיפה.

Watch this Scientific Journal Video about Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction at JoVE.com

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

מאמר זה מתאר שיטה להשיג תלת ממדי (3D) מבנה של מולקולות התאספו helically באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים אסיפות HIV-1 capsid כדי להמחיש את הליך שחזור מפורט 3D להשגת מפת צפיפות לפי שיטת איטרטיבי אמת בחלל הסליל מחדש.

מבנה של HIV-1 הרכבות capsid על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים cryo-ו איטרטיבי לשיקום שטח נדל סליל

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. מאמר זה מתאר שיטה להשיג תלת ממדי (3D) מבנה של מולקולות התאספו helically באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים אסיפות HIV-1 capsid כדי להמחיש את הליך שחזור מפורט 3D להשגת מפת צפיפות לפי שיטת איטרטיבי אמת בחלל הסליל מחדש.

Video: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

הערכת Dynamic תכונות רלוונטיים Immunologically מבנית השלישון של HIV-1 רצף V3 קראון Loop R2 על ידי מבראשית מתקפל

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...