עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF, P20619 וP22988 לBZ).

הכנת מדגם מיקרוגל סיוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הכנת מדגם אחד צריכה לתכנת מעבד האוטומטי מיקרוגל רקמות למיקרוסקופ אלקטרונים (EM היקה AMW; Microsystems היקה, וינה, אוסטריה) עם הפרוטוקולים הבאים (טבלה 1) להכנת מדגם סיוע מיקרוגל למשך TEM: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="טבלה 1" /> טבלת 1. פרוטוקול להכנת מדגם באמצעות קרינת מיקרוגל. העמודות השונות להראות (משמאל לימין): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר הבקבוקון (ע&quot;נ בקבוקון.) מייצג את הסדר שבו הבקבוקון נטען לקרוסלה של המעבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב של התהליך בפועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים בבקבוקונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך הצעד הממשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורה המקסימלית שהגיעה בבקבוקון לפני הקרנת המיקרוגל כבויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת קרינת מיקרוגל: הרציף = incre הטמפרטורה המהירהase, מחזיק טמפרטורה שנקבעה; סלופ = עלייה עדינה טמפרטורה, טמפרטורה סופית הגיעה בסוף; פעם = טמפרטורת גידול, כוח ראפיד כבוי עד שהטמפרטורה ירדה 5 ° C, הכח חדש יגיע לטמפ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספק מקסימאלי של קרינת המיקרוגל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין את הפתרונים לשלבים השונים שתוארו בפרוטוקול הכנת המדגם (עבור שרף אפוקסי אגר 100 ראה 1.7), למלא אותם לתוך הצלוחיות המיועדות על פי הפרוטוקול המתוכן (טבלה 1), טען את הבקבוקונים בקרוסלה, ואז להכניס קרוסלה לתוך מעבד רקמת המיקרוגל, ולבסוף לטעון את הבקבוקון הראשון לבית הבליעה מונה המצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור את החלקים קטנים של עלים (1 מ&quot;מ 2) מtabacum Nicotiana נגוע בנגיף פסיפס טבק (TMV) בסכין גילוח על צלחת שעוות דוגמנות בירידה של 3% glutaraldehyde (אגר מדעי בע&quot;מ, סטנסטד, אנגליה) ב60mm סורנסן פוספט חיץ (pH 7.2) בטמפ &#39;החדרerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את החלקים עם פינצטה העדינה מייד לתוך הסלים הייעודיים עם רוחב רשת של כ 200μm. לערום את הסלים על גבי זה ולהכניס אותם לתוך התא מונה המצב. יש להקפיד כי הדגימות מכוסות כל זמן עם פתרון מקבע במהלך טעינה וערימה של הסלים כדי שלא יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל פרוטוקול העבר המתוכן מיקרוגל סיוע מדגם הכנה לקיבעון, התייבשות וחדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הכנת מדגם מתבצעת באופן אוטומטי על ידי מעבד רקמת המיקרוגל להמשיך בצביעה שלילית עם החומר צמחי שנותר כאמור בסעיף 3 (מכתים שלילי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין שרף אפוקסי אגר 100 על ידי ערבוב את הרכיבים הבאים כמתואר: 24G אגר מילוי 100, אנהידריד succinic 16G dodecenyl, ואנהידריד 10 גרם מהתיל nadic (עבור כל הרכיבים לראות אגרו מדעי בע&quot;מ, סטנסטד, אנגליה) בכוס פלסטיק, החום זה40 ° C ולערבב אותו היטב. הוסף 1.2g של נזיל dimethylamine ומערבב היטב. מלא שרף אפוקסי אגר 100 לתוך פילמור המיועד מהווה רק לפני מדגם פרוטוקול ההכנה מגיע לסיומה (למשל בשלב 22 בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרוטוקול סיים (אחרי השלב 22 בטבלה 1) לשחרר את הסלים מוערמים המכילים את דגימות הסתננות מחדר המצב מונה לבקבוקון האחרון של הקרוסלה. הסר את הקרוסלה ממכשיר המיקרוגל, unstack הסלים ומעלים אותם באמצעות פינצטה העדינה לתוך טפסי פולימריזציה הייעודיות. יש להקפיד כי הדגימות תמיד מכוסות בשרף אפוקסי אגר במהלך 100 unstacking וטעינה כדי שלא יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטאק את צורות פולימריזציה על גבי השני. יש להקפיד כי הדגימות תמיד מכוסות בשרף אפוקסי אגר במהלך 100 לערום וטעינה כדי שלא יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקונים שמשו בעבר מהקרוסלה של המיקרוגל tissue המעבד, טען אותו עם סלים המוערמים ולהכניס את הקרוסלה לתוך מעבד רקמת המיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל פרוטוקול פילמור העבר המתוכן (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד פילמור מתבצע באופן אוטומטי על ידי מעבד רקמת המיקרוגל, לבחון רשתות שליליות מוכתמות במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים [למשל פיליפס CM10 TEM, פיי (לשעבר פיליפס), איינדהובן, הולנד] ולבצע ניתוח תמונה כאמורה בסעיף 3 ו 4 ( מכתים שלילי וניתוח תמונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרוטוקול הוא סיים להסיר את צורות פולימריזציה מהתא מונה המצב, unstack צורות פולימריזציה ולהסיר את אובניים polymerized המכיל את הדגימות. עכשיו הם מוכנים להיות נותחו עם microtome. </li></ol> 2. זמירה וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בלוקים אחת או יותר למחזיקי מדגם נפרדים לultrathin חתך עם המדגם בדבק עליון על 1cm מתוך המחזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חתוך את הבלוק עם גוזם דגימה לTEM (למשל היקה רייכרט Ultratrim; Microsystems יקה), כך שפן בלוק של מקסימום. 1mm באורך ורוחב ב200μm שמכיל חומר עלה ככל האפשר מושג (לחסום גודל פנים אולי צריך להיות מותאם לגודל של סכין היהלום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף לחסום עם ultramicrotome (למשל רייכרט יקה Ultracut S; Microsystems יקה) באמצעות סכין יהלום בזווית של 45 מעלות סכין (למשל Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, אוסטריה). עובי הסעיף צריך להיות מותאם לכ 70 עד 90 ננומטר ומהירות החיתוך צריכה להיות בסביבות 1 מ&quot;מ / s. לאסוף את מספר מקטעים עם formvar (אגר מדעי בע&quot;מ) רשת מצופית נחושת או ניקל 200 כיכר רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר להכתים את החלקים על הרשת עם ציטרט עופרת (אגר מדעי בע&quot;מ; ציטראט העופרת 1.1g מומס במים מזוקקים ו42ml כפולים 8ml 1N NaOH) במשך 5 דקות בצלחת פטרי מלא בחלקן NaOH ליצור CO 2-חופשיים סביבה ועבור 15 מיילnutes עם 1% יצטט uranyl (אגר מדעי בע&quot;מ) מומס במים מזוקקים בטמפרטורת חדר. שוטף את הרשתות במים מזוקקים למשך 1 דקה בין כל שלב שלאחר צביעה. אוויר יבש הרשתות בתיבת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הסעיפים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (למשל פיליפס CM10 TEM, פיי, איינדהובן, הולנד). </li></ol> 3. מכתים שלילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסיף על 100 מ&quot;ג מחומר עלה TMV הנגוע ולהכין מוהל גס על ידי שמאחד את החומר ל2 דקות בסכין גילוח בשקופית מיקרוסקופ ב100μl של 60mm Søfrensen פוספט חיץ (pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20μl של homogenate כתוצאה על הבאר הראשונה של שקופית מיקרוסקופ מצופי טפלון עם 4 או יותר בארות (לחלופין אפשר גם להעביר homogenate על פיסת parafilm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רשת מצופית formvar על גבי homogenate עם צד formvar (אגר מדעי בע&quot;מ) המצופה פונה כלפי הטיפה וincuלהוריד לו במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרשת פי 2 עבור 2 דקות כל אחד על ידי הצבת הרשת על גבי שתי טיפי 200μl 60mm סורנסן פוספט החיץ (pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הרשת למשך 1 דקה בתמיסה ב60mm סורנסן פוספט חיץ (pH 6.5) חומצת phosphotungstic 2% מוכן טרי (אגר מדעי בע&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשת ולאפשר לו לייבוש באוויר בתיבת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרשת עם מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (למשל פיליפס CM10 TEM; פיי, איינדהובן, הולנד). קח לפחות 10 תמונות של virions שלילי המוכתם שנבחר באקראי (לפחות 10 או יותר virions צריך להיות גלוי על כל תמונה) עם מיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים בהגדלה ראשונית של 21000X או גבוה יותר. יש להקפיד שכל התמונות יש את אותה גדלה. </li></ol> 4. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את האורך והרוחב של לפחות 100 חלקיקי נגיף יחיד שנבחרו באקראי על micrographs נלקחאת הדגימות שליליות המוכתמות על ידי שימוש בכל תוכנת מחשב ניתוח תמונה [למשל התא D (אולימפוס, חיים והחומר המדע Europe GmbH, המבורג, גרמניה) עם כלי ניתוח החלקיק או Optimas 6.5.1-(מדיה קיברנטיקה Inc, בתסדה, מרילנד, ארה&quot;ב)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ממוצעים וסטיות תקן על מנת להשיג אורך ורוחב ממוצע של חלקיקי הווירוסים מדמיינים ידי מכתים שיטות שליליות וTEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה בין האורך ולתכונות ultrastructural (שהושג ב2.5) עם גדלים של וירוסים ושינויים הנגרמים על ידי מחל ultrastructural וירוס מוכרים בספרות במטרה לזהות בבירור את המחלות הנגיפיות. </li></ol> 5. תוצאות נציג: לאחר שינויי מיקרוגל סייעו מדגם הכנה טיפוסיים TMV מושרים ultrastructural כגון שטחים גדולים המכילים נגיפים מיושרים בצורה מקבילה יכולים להיות שנצפו במיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים בcytosol של Nicotian הנגועבתאי tabacum (האיור 1 א). בנוסף, במוהל הגולמי של נגוע TMV משאיר חלקיקי TMV יכולים להיבחן כמבני flexuous, בצורת מוט לאחר צביעה שלילית (האיור 1B). ניתוח תמונה של 100 חלקיקי נגיף מתגלה גודל ממוצע לTMV של 280nm באורך ורוחב ב17nm (איור 2). Ultrastructure בתאי TMV נגועים ובגודל של נגיפים שנצפו במחקר זה נמצא כי בהתאם למאפייני ultrastructural TMV מושרים בטבק וטווח הגודל של חלקיקי TMV שדווח בעבר בספרות 9-15. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="איור 1" /> האיור 1. Micrographs אלקטרון ההולכה של תאים וvirions עלים TMV נגועים. א) תמונה מראה את ultrastructure של תאי עלי mesophyll TMV הנגועים של tabacum Nicotiana לאחר הכנת מדגם צמח מוגנת מיקרוגל. שים לב השטח הגדול של נגיפים מיושרים מקבילים אשר נצברו בcytosol.C = הכלורופלסט עם עמילן (סנט), M = mitochondrion, N = גרעין, V = vacuole, בר = 2μm. B) תמונה מראה virions שאותרו על ידי מכתים שלילי במוהל עלים נגועים. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. גודל יחסי של נגיפים. התפלגות יחסית של אורך ורוחב של TMV חלקיקים לאחר מכתים שלילי מיץ עלים נגועים כפי שהופיעו במיקרוסקופ האלקטרונים. משמעות ערכים (כלומר אורך / רוחב ± סטיית תקן) חושבה מתוך 100 virions.

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy. , (1999).</li><li>Kuo, J., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+plant+tissues+for+ultrastructural+study.">Processing plant tissues for ultrastructural study.</a> Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. 369, 47-65 (2007).</li><li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-assisted+tissue+processing+for+sameday+EM-diagnosis+of+potential+bioterrorism+and+clinical+samples.">Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples.</a> Micron. 37, 577-590 (2006).</li><li>Webster, P., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-assisted+processing+and+embedding+for+transmission+electron+microscopy.">Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. 369, 47-65 (2007).</li><li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+assisted+rapid+plant+sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy.">Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 233, 258-268 (2009).</li><li>Ler&#237;a, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation,+using+dedicated+hardware,+minimizing+heat-related+effects.">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy.">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li><li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy.">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li><li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus.">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).</li><li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+force+microscopy+study+for+the+assembly+structures+of+tobacco+mosaic+virus+and+their+size+evaluation.">An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation.</a> Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).</li><li>Milne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+tobacco+mosaic+virus+in+tobacco+leaf+palisade+cells.">Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells.</a> Virology. 28, 527-532 (1966).</li><li>Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells.">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li><li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., F&#228;ndrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications.">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li><li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases.">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li><li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy:+a+four-hour+protocol.">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכנת מיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור TEM הוכחה לספק נתוני ultrastructural מהירים ואמינים תוך כמה שעות 3,4,16. שימור מבני הקנס של אברונים וקרומים שהושגו עם השיטה המשמשת במחקר זה היה דומה לדגימות קונבנציונליות וcryofixed 5,15 עם היתרון של הפחתה מסיבית בקיבעון מדגם והטבעת הזמן של 3 ימים או יותר לכ 2 שעות. זה מייצג את פרוטוקול הכנת המדגם המהיר ביותר לTEM הזמין כרגע בספרות. השיטה המתוארת במחקר זה בשילוב הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור TEM עם שיטות צביעה שליליות שאפשרו זיהוי ברור ומהיר של שינויי ultrastructural TMV מושרים והסוכן הנגיפי עצמו. שינויי ultrastructural TMV מושרים יכולים להיחקר לאחר זמירה, תבתר ולאחר צביעה בתוך כ 4 שעות לאחר תחילתו של קיבעון בשידור elecטרון מיקרוסקופ. שימוש באופן אוטומטי לחלוטין מצב הכנת הדגימה שחרר חוקר לנהל מכתים שלילי בתקופת ביניים על מנת לקבוע את הגודל ורוחבו של הסוכן הנגיפי. לפיכך, אנו יכולים להסיק כי שיטה זו מאפשרת אבחנה ברורה ומהירה של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום שיש חשיבות רבה לשימוש בעתיד בניסויי חקלאות ומדעית במפעל phytopathology. כשיטה זו יכולה לשמש גם לאבחון המהיר של מחלות בבעלי חיים ובני אדם שיש לו פוטנציאל גדול ליישום עתידי בפתולוגיה רפואית ווטרינרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב / הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> tetroxide אוסמיום </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> 100 שרף אגר </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> אנהידריד succinic Dodecenyl </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> אנהידריד nadic תיל </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> נזיל dimethylamine </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> להוביל ציטראט </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> תצטט Uranyl </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Phosphotungstic </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> אגר מדעי בע&quot;מ </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> היקה EM AMW </td><td> Microsystems היקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ליקה (רייכרט) Ultratrim </td><td> Microsystems היקה </td><td></td><td> חדש מודל זמין </td></tr><tr><td> ליקה (רייכרט) Ultracut S </td><td> Microsystems היקה </td><td></td><td> חדש מודל זמין </td></tr><tr><td> Diatome Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פיליפס CM10 TEM </td><td> פיי (לשעבר פיליפס) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> חדש מודל זמין </td></tr><tr><td> התא D </td><td> אולימפוס בע&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> מדיה קיברנטיקה בע&quot;מ </td><td></td><td> גרסה חדשה זמין </td></tr></tbody></table>

microwave assisted rapid diagnosis of plant virus diseases by transmission electron microscopy

חקירות של שינויי ultrastructural נגרמים על ידי וירוסים לעתים קרובות יש צורך לזהות בבירור מחלות ויראליות בצמחים. עם הכנת מדגם קונבנציונלית למיקרוסקופיה אלקטרוני הילוכים (TEM) חקירות כאלה יכולות לקחת כמה ימים 1,2 ולכן אינו מתאימות לאבחון מהיר של מחלות נגיפיות צמח. קיבעון מיקרוגל יכול לשמש בצורה דרסטית כדי לקצר את זמן הכנת מדגם לחקירות TEM עם תוצאות דומות לאלו של ultrastructural נצפה לאחר קונבנציונלית הכנת מדגם 3-5. מכשירים רבים ושונים בהתאמה אישית מיקרוגל זמינים כרגע שיכול לשמש לקיבוע וההטמעה של דגימות ביולוגיות לחקירות TEM 5-8 המוצלחים. במחקר זה אנו מראים על וירוס פסיפס טבק (TMV) נגוע צמחי tabacum Nicotiana כי ניתן לאבחן שינויים בultrastructural עלים כבחצי יום באמצעות הכנת מדגם מיקרוגל סיוע עבור TEM. יש לנו נבחרנו לבצע את המחקר הזה עם מכשיר מיקרוגל זמין מסחרי כפי שהוא מבצע הכנת מדגם כמעט במלואו באופן אוטומטי 5 בניגוד למכשירים האחרים הזמינים בו צעדים רבים עדיין צריכות להתבצע באופן ידני 6-8 והם יותר ולכן זמן רב עבודה. כהכנת מדגם מתבצעת באופן אוטומטי לחלוטין מכתים שלילי של חלקיקים נגיפיים בלשד העלים TMV הנגועים הנותרים והבחינה הבאה של ultrastructure וגודל ניתן לבצע במהלך קיבעון והטבעה.

Watch this Scientific Journal Video about Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

מחקר זה מתאר שיטה המאפשרת אבחון המהיר וברור של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום באמצעות שילוב של הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים ושיטות צביעה שליליות.

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  University of Graz. מחקר זה מתאר שיטה המאפשרת אבחון המהיר וברור של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום באמצעות שילוב של הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים ושיטות צביעה שליליות.

Video: Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

מבנה של HIV-1 הרכבות capsid על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים cryo-ו איטרטיבי לשיקום שטח נדל סליל

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...