עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (פרויקט BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und אני dentifizierung פון bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). אנו מודים ב Diemar (Charité-Universitätsmedizin ברלין, Institut für Pharmakologie) לקבלת סיוע טכני מעולה.

1. פרוטוקול - IgY-מיצוי באמצעים של PEG-משקעים איור. 1 נותן תרשים סכמטי של ההליך IgY-החילוץ (ראה טבלה 2). פרוטוקול תוארה לראשונה בשנת Polson et al. 1980. כל הצעדים צריכים להתבצע באמצעות כפפות לטקס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפת הביצה סדוקה בזהירות את החלמון מועבר &quot;כפית חלמון&quot; על מנת להסיר כמו ביצה לבנה הרבה האפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלמון מועבר נייר מסנן והתגלגל להסיר הנותרים חלבון ביצה, ולאחר מכן העור חלמון הוא חתך עם ניתוח או מכשיר דומה (פיפטה קצה). החלמון הוא שפך לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל לבין נפח ביצה רשום (V1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים חלמון ביצה נפח PBS מעורבב עם 6000 (ΣV1 + V2) חלמון לאחר מכן, PEG 3.5% (בשנת גרם, מרסקים) מהנפח הכולל הוא הוסיף vortexed, ואחריו 10 דקות מתגלגל על ​​מערבל מתגלגל. צעד זה של ההליך מיצוי מפרידה את ההשעיה בשני שלבים. אחת שלב מורכב &quot;מוצקים חלמון וחומרים שומניים&quot; (הציטוט המקורי של Polson et al. 1980) ושלב מימית המכילה חלבונים IgY אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצינורות הם centrifuged על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (10,000 סל&quot;ד פי 13,000 XG, הרוטור Heraeus Multifuge 3SR, + זווית קבועה). Supernatant (V3) הוא שפך דרך פילטר מקופל הועבר צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6000 PEG 8.5% בשנת גרם (מחושב לפי נפח חדש) מתווספים הצינור, vortexed והתגלגל על ​​מערבל מתגלגל כמו בשלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4 עם הבדל כי supernatant נמחקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה היא מומס בזהירות באמצעות מקל זכוכית vortexer ב 1 מ&quot;ל PBS. PBS מתווסף נפח סופי של 10 מ&quot;ל (V4). הפתרון הוא מעורבב עם PEG 6000 12% (w / v, 1.2 גרם) ו כאל בשלב 3 (, מערבולת מערבל מתגלגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6 ו לפזר את גלולה בקפידה PBS 800 μl (מקל זכוכית מערבולת). חכו את בועות האוויר להיעלם ולאחר מכן להעביר (פיפטה) תמצית אל כמוסת דיאליזה. יש לשטוף את הצינורית עם 400 PBS μl ולהוסיף נפח למכשיר דיאליזה (V5). (להכנת התקנים דיאליזה ממברנות ראה נספח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית היא dialysed על הלילה מלח 0.1% (1600 מ&quot;ל) ובחש בעדינות באמצעות stirrer מגנטי. למחרת בבוקר, מלוחים הוא הוחלף על ידי PBS ו dialysed לעוד שלוש שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן IgY-לחלץ הוא משך מתוך הקפסולה דיאליזה על ידי טפטפת והועברו צינורות 2ml. הנפח הסופי הוא סביב מ&quot;ל 2 (V6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכולת החלבון (מ&quot;ג / מ&quot;ל) של דגימות נמדד photometrically ב 280 ננומטר (01:50 מדולל PBS) וכן חושבו על פי חוק למברט-באר עם מקדם הכחדה של 1.33 עבור IgY (ראה איור. 2), איור . 4 מראה את איכות של התכשיר (טוהר התאוששות הם סביב 80%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לאחסן את דגימות aliquots ב -20 ° C (לא להקפיא את דגימות ב -70 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכות בהכנות האחרונות מנותח על ידי פשוט SDS-PAGE כמתואר יופיטר פרוטוקול <a href="http:/www.jove.com/details.php?id=1916">http:/www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. נספח א &#39;, לפני השימוש בשקית הדיאליזה חייבים להיות מוכנים באופן הבא על פי המלצות היצרן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 שקיות דיאליזה נחתכים לחתיכות של 30 ס&quot;מ, נתון בכוס זכוכית 2000 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1750 מ&quot;ל של 5 מ&quot;מ EDTA-הפתרון מתווספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך זכוכית ממוקם מעל השקיות על מנת להבטיח כי שקיות מכוסים על ידי הפתרון EDTA. הפתרון הוא מחוממת מבושל דקות 5 (פלטה). הפתרון הוא יצק את שקיות נשטפים שלוש פעמים במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב 1750 מ&quot;ל EDTA-הפתרון מתווספים, מבושל 5 דקות ושטף שלוש פעמים במים מזוקקים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף השקיות דיאליזה הם מבושל 10 דקות במים מזוקקים ולאחסן ב 4 ° C. קח את שקיות הדיאליזה באמצעות פינצטה מעוקרים. </li></ol> 3. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים סכמטי של מיצוי-IgY באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול פי התיאור המקורי של Polson et al. 1980. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">כדי להציג תמונה מוגדלת לחץ כאן.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. פיתוח בסך הכל ב-IgY חלמון ביצה של תרנגולות לחסן התלות של גיל. בהינתן הוא אומר שבועי בסך IgY / ביצה ו SD (n = 4 תרנגולות מטילות). מ [פאולי et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Layiיכולת ניטור ng ארבע תרנגולות שחוסנו עם אנטיגנים שונים. החצים מצביעים על תאריך חיסון (מ [פאולי et al. 2009]). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">כדי להציג תמונה מוגדלת לחץ כאן.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. Polyacrylamide-Gelelectrophoresis ההכנות IgY בודדים ביצים שונים תחת צמצום התנאים ליין 1 - סמן משקל מולקולרי, ליין 2 - IgY סטנדרטיים, ליין 3-5 - דגימות IgY שונים שהוכנו כמתואר בפרוטוקול. אלה ההכנות האחרונות על פי שלב 10 של פרוטוקול. HC - שרשראות כבדות, LC - chaines אור,? - זיהומים קלים המתאימים משקל מולקולרי סביב 35 kDa (כנראה שבר בטרמינל C-II של מבשר vitellogenin, [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td> עוף 21 (Antigen) </td><td> עוף 22 (Antigen) </td><td> עוף 19 (B Antigen) </td><td> עוף 23 (ג Antigen) </td></tr><tr><td> מספר ביצים (IgY סה&quot;כ) 1, 2 שנות תקופה </td><td> 625 (38 גרם) </td><td> 626 (38 גרם) </td><td> 545 (33 גרם) </td><td> 608 (37 גרם) </td></tr><tr><td> ביצה מספר (IgY סה&quot;כ), בשנה הראשונה </td><td> 345 (20 גרם) </td><td> 304 (16 גרם) </td><td> 326 (18 גרם) </td><td> 308 (17 גרם) </td></tr><tr><td> ביצה מספר (IgY סה&quot;כ), בשנה השנייה </td><td> 280 (18 גרם) </td><td> 322 (21 גרם) </td><td> 219 (15 גרם) </td><td> 300 (20 גרם) </td></tr><tr><td> % של מקס. ביצה מספר גדול ככל האפשר (שנה ראשונה) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % של מקס. ביצה מספר גדול ככל האפשר (שנה שנייה) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> מספר ביצים מעובדים </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 כמות IgY הכולל מחושב על ידי הכפלת מספר ביצים לפי ערך ממוצע של 60 מ&quot;ג חלבון ביצה על פי נתונים של תרשים 2. 2 מקסימום. מספר הביצים אפשרי בשנה הוא 325 על פי מידע של המגדל. טבלה 1. שנתיים הסטטיסטיקה של יכולת ההטלה של התרנגולות שחוסנו עם אנטיגנים שונים. הנחת קיבולת אחוזים לכל היותר ארבע תרנגולות לאחר חיסון עם אנטיגנים שונים, כמו גם את IgY-התוצאה במהלך שנתיים (ראה גם איור. 3), [פאולי et al. 2009]). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ביצה מס. </td><td> חן Nr. הנחת תאריך </td><td> V1 [מ&quot;ל] חלמון </td><td> V2 [מ&quot;ל] PBS </td><td> 1. PEG prec. [ז] </td><td> כרך [מ&quot;ל] לאחר </td><td> 2. PEG prec. [ז] </td><td> גלולה </td><td> 3. PEG prec. [ז] </td><td> גלולה </td><td> כרך [מ&quot;ל] </td><td> חלבון מ&quot;ג סה&quot;כ / ml </td><td> חלבון הכולל תיקון מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. סינון V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> מומס מ&quot;ל PBS V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> מומסים מ&quot;ל PBS V5 </td><td> אחרי דיאליזה נגד PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הפרוטוקול למופת של PEG משקעים

<ol>
	<li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain.">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li><li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins:+a+review.">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li><li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h., Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly,+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li><li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+laying+capacity,+immunoglobulin+Y+concentration,+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period.">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li><li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens.">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li><li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , (2001).</li><li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li><li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies.">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי Landesamt פרווה גזונטהייד und Soziales ברלין (H 0069/03).

הבחירה של שיטת IgY מתאים טיהור מושפעת סולם של היטהרות (מעבדה או תעשייה), עלות יעילות, טכנולוגיה (ציוד מעבדה), ואת ההשפעה על הסביבה (ניהול פסולת). שיטות שונות להפקת IgY נסקרו בהרחבה על ידי דה Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, לבדיקה לראות גם שאדה et al. 2005). באופן כללי, השיטות הללו ניתן לחלק לשלוש קבוצות עיקריות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטות רטיבות: מעורבים אמוניום או נתרן סולפט, polyethyleneglycol (PEG), חומצה caprylic ו caragenean. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטות chromatographic: זיקה כרומטוגרפיה, כרומטוגרפיה מחליפי יונים, כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי, כרומטוגרפיה אינטראקציה thiophylic, ואת ג&#39;ל סינון כרומטוגרפיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultrafiltration. </li></ol> טוהר הכנה IgY יכול להיות מוגברת על ידי שילוב של שיטות, למשל, PEG משקעים ניתן לשלב עם זיקה כרומטוגרפיה. במקרים מסוימים, בהתאם ליישום הסופי, תמצית של מים IgY מספיקה כדי להשיג תוצאות טובות (אקיטה &amp; Nakai 1993). על פי הניסיון שלנו, IgY-מדגם נקבל על ידי PEG-משקעים עבד טוב מאוד בהרבה מבחני החיסונית שונים. על ידי סטנדרטיזציה בשיטת PEG-משקעים עוזר אחד טכני הוא מסוגל לעבד כ 84 ביצים בשבוע, אשר מתאים בסכום של IgY הכולל בין 4 ל 7 גרם בשבוע. חישוב פשוט: הנחת תרנגולת הוא מחוסן עם אנטיגן. לאחר חיסונים להגביר כמה תרנגולת מייצר נוגדנים ספציפיים (AB) עם titre של 1:50,000, במשך תקופה של 30 ימים. 30 ביצים x 2 מ&quot;ל IgY לחלץ (ראה פרוטוקול איור. 3) מתאים IgY 60 מ&quot;ל הכולל, אשר בתורו המתאים דילול Ab-l של 3000 (את הקיבולת של הדלי הוא 10 ליטר), זה אומר עם אני 3000 הפתרון Ab 300 דליים יכול להיות מלא. לכן, לאור כמות כזו Ab-עצום אין בעיה לאחסן Ab-הבריכה של איכות סגוליות מתמיד. טכניקה זו מפחיתה את השתנות תשלום / הרבה נצפתה אחרת polyspecific Ab. למרות ההיבט של כמות, IgY Ab יש יתרונות נוספים בהשוואה IgG יונקים: אין הפעלה של מערכת המשלים יונקים, לא תגובתיות צולבת עם HAMA (עכבר אנושי נוגדנים נגד), גורמים שגרונית או אדם קבוצה דם אנטיגנים (חוסר heteroagglutinins). היתרון הבולט של IgY-Ab הוא המרחק שנקרא פילוגנטי. מרחק פילוגנטי הסיבה להבדלים המתואר לעתים קרובות בין ספציפיות Ab של יונקים ועופות, גם כאשר שחוסנו זהה. בנוסף ההבדלים בין יונקים את המערכת החיסונית העופות עצמם, הבדלים בפיתוח פילוגנטי אלה שני מעמדות בעלי חיים תורמת ספציפיות שונות Ab. מחברים אחדים דיווחו כי לעתים קרובות לייצר תרנגולות Abs נגד מבחינה פילוגנטית יונקים חלבונים או פפטידים שמור ביותר ביעילות רבה יותר מאשר לעשות ארנבים (לבדיקה לראות שאדה et א 2005). כתוצאה מכך, נשמרת אנטיגן יכול להישאר &quot;רעולי פנים&quot; למערכת החיסון ארנב, ובכך לגרום רק חלש או תגובה &quot;שקט&quot;. יתר על כן, אם תרנגולות וארנבות הם שחוסנו עם האנטיגן יונקים אותו, לעתים קרובות התרנגולות להגיב עם סגוליות-Ab זה יכול להיות מושגת רק לעתים נדירות ארנבים. גם את ההיבט של רווחת בעלי חיים חשוב מאז Ab הם הלא פולשני מופק חלמון ביצה. בשילוב עם חיסון (הפלסמיד) Gene-Gun IgY הייצור הוא לגמרי לא פולשנית (ויטקובסקי et al. 2009). לסיכום, את הייצור של Ab ב התרנגולות ואת IgY-מיצוי באמצעים של PEG-המשקעים היא מאוד חסכונית תוצאות Ab מאוד ספציפיות עם titres יציב עד 1:1,000,000. בשל המרחק בין פילוגנטי Aves ו יונקים, עופות מסוגלים לייצר Ab ספציפיים נגד אנטיגנים יונקים שמור ביותר לעומת ארנבים למשל. כמות יוצאת דופן של Ab מתקבל על ידי IgY הטכנולוגיה פותח את הדלת גם עבור שימוש IgY-Ab ברפואה אדם ולשימוש וטרינרי למטרות טיפוליות / מניעתי.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyse Visking תיק, סוג 27/32, מנותקים -14 KD, קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלקון צינורות Blue Max, 50 מ&quot;ל Tube פוליפרופילן חרוטי, בקטון דיקינסון labware, פרנקלין לייקס ניו יורק, ארה&quot;ב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקופל סינון MN 615 ¼, ∅ 150 מ&quot;מ, קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה Heraeus </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stirrer מגנטי, Variomag מונו, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-Dialyse-Capsule 5,0 מ&quot;ל, קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוטומטר UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, דואיסבורג, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליאתילן גליקול 6000, Rotipuran הדוקטורט Eur. קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעורבבים מראש PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, מנהיים, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולר מיקסר SRT2, סטיוארט, סטאפורדשייר, אנגליה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, איקא-Labortechnik, Staufen i.Br., גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפית חלמון, Fackelmann (תופעות houshold), גרמניה </li></ol>

igy technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (peg) precipitation

תרנגולות ניתן לחסן באמצעות החיסון im (שריר הפקטוראלי, שמאל וימין, נפח הזרקה 0.5-1.0 מ&quot;ל) או באמצעות חיסון פלסמיד-Gene-Gun. תלוי immunogenicity של האנטיגן, גבוה נוגדנים titres (עד 1:100,000 - 1:1,000,000) יכולה להיות מושגת רק אחרי אחת או 3-4 חיסונים דחיפה. בדרך כלל, תרנגולת מטילה ביצים ברציפות במשך כ -72 שבועות, לאחר מכן פוחתת יכולת הנחת. פרוטוקול זה מתאר את החילוץ של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות הליך משקעים (PEG. Polson et al. 1980). השיטה כוללת שני צעדים חשובים. הראשון הוא הסרת שומנים והשני הוא משקעים של IgY הכולל supernatant של צעד אחד. אחרי דיאליזה נגד חיץ (בדרך כלל PBS) IgY-לחלץ ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה. טוהר לחלץ הוא סביב 80%, את סך IgY לביצה נע בין 40-80 מ&quot;ג, תלוי בגיל תרנגולת הנחת. תוכן הכולל IgY עולה עם הגיל של התרנגולת מן סביב 40 ​​מ&quot;ג / ביצה עד 80 מ&quot;ג / ביצה (ביחס PEG המשקעים). יכולת הנחת תרנגולת בשנה הוא כ 325 ביצים. כלומר, פוטנציאל יבול כולל של IgY גרם 20 שנה בסך הכל / מבוסס על תוכן IgY ממוצע של ביצה 60 מ&quot;ג סה&quot;כ IgY / (ראה לוח 1).

Watch this Scientific Journal Video about IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation at JoVE.com

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

פרוטוקול זה מתאר מיצוי מסוים של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול ונותן מידע כללי על טכנולוגיה IgY.

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

igy-technology-extraction-chicken-antibodies-from-egg-yolk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

64.1K Views.  Robert Koch-Institute. פרוטוקול זה מתאר מיצוי מסוים של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול ונותן מידע כללי על טכנולוגיה IgY.

Video: IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...