בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בחילוף החומרים של אדיפוציטים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות אדיפוציטים. שיטה זו עברה אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציט בוגר, אשר יכול לשמש לניתוח פונקציונלי של צמיחת שומן מוקדם בחיים ועובר התפתחות אצל אפרוחים.

תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה מאוד בין תרנגולות לבני אדם. לכן, preadipocytes מבודדים יכולים לשמש כמודל מוצע כפול למחקרים רלוונטיים לבני אדם ועופות. כדי להתחיל לטבול את הגוף העובר עם 70% אתנול.

לאחר מכן כדי למנוע הפרעות במהלך הסינון בשלבים מאוחרים יותר לאחר העיכול קרצפו בעדינות את פני העור עם גזה סטרילית כדי להסיר נוצות. לאחר מכן חתכו את העור בין הרגליים לאזור הבטן כדי לחשוף את זוג מחסני שומן הירך. השתמש במלקחיים מעוקלים ביד אחת כדי להחזיק את העור סביב הרגל ולהסיר בעדינות את השומן התת עורי הירך.

עם היד השנייה. מאוחר יותר, השתמש במלקחיים מעוקלים כדי למשוך בעדינות את המחסן הרחק מהרגל. מעבירים את הרקמות לצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטרים של מדיית איסוף וחוזרים על הנתיחה לצד השני של כרית השומן.

כעת, העבירו את רפידות השומן שנאספו לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת עיקור ושטפו לזמן קצר על ידי מערבולת המנה מספר פעמים. לאחר מכן יש לשטוף את תמיסת העיקור על ידי העברת רפידות השומן לצלחת פטרי 60 מילימטר המכילה PBS. סובבו בעדינות את הצלחת ושוב, התרחצו עם PBS.

לעיכול של רקמות השומן, להעביר אותם לצינור 15 מילימטר המכיל תמיסה אנזימטית טרום חמה. לאחר מכן לטבול זוג מספריים ישרים ארוכים בצינור ולבסוף לטחון את רקמות השומן בתמיסה לחתיכות קטנות ככל האפשר. מעבירים את הרקמה הטחונה והתמיסה האנזימטית לבקבוקון אוטו-חלבי של 25 מיליליטר.

עוטפים את הבקבוקון בסרט פרפין ומניחים את הבקבוקון באינקובטור שייקר מסלולי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. לאחר העיכול, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר מכן הסר את כל הפיסות של רקמות ופסולת לא מעוכלות על ידי סינון דרך מסננת רקמה של 250 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר על ידי צנרת.

כעת, הסר את התאים שנדבקו לבקבוקון על ידי שטיפת הבקבוקון עם ארבעה מיליליטרים של מדיית גדילה וסנן את תרחיף התא לאותו צינור 15 מיליליטר. לאחר מכן יש לשטוף את המסננת על ידי צנרת מדיית הגדילה שוב כדי להסיר את כל התאים הלכודים במסנן. צנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לפוצץ את שבר התא ולשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא.

יש לבצע החייאה עדינה של הכדור במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאי דם אדומים, לערבב היטב על ידי צנרת ולדגום במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דיללו את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של מדיית גדילה לצינור המכיל את התאים וערבבו אותם בעדינות על ידי צנרת. כעת, טפטפו את התאים למסננת תאים של 40 מיקרומטר וסיננו אותם לצינור חדש של 50 מיליליטר.

לאחר מכן יש לשטוף את המסננת עם חמישה מיליליטרים נוספים של מדיית גדילה ולהשליך את התאים על ידי צנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוף את supernatant. בצעו שימוש חוזר בכדור התא הנותר במיליליטר אחד של מדיית גדילה על ידי צנרת כדי לקבוע את צפיפות התאים ואת יכולת הכדאיות, ערבבו 10 מיקרוליטרים של כל דגימה בכחול טריפאן על ידי צנרת.

טען 10 מיקרוליטרים של התערובת על ההמוציטומטר וספור את התאים. ניתוח של פראדיפוציטים לאחר 24, 48 ו-72 שעות הראה מורפולוגיה ומספר תאים תקינים. אינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים הראתה התמיינות מהירה והצטברות של טיפות שומנים.

טיפול אגרסיבי בפראדיפוציטים במהלך הבידוד גרם לנזק לתאים ולמספר תאים נמוך. זיהום מיקרוביאלי ניתן לראות למרות נקיטת אמצעי מניעה. צביעת שומנים בשמן אדום O הצביעה על כך שהפרדיפוציטים מתחילים לפתח במהירות טיפות שומנים תחת תמריצים אדיפוגניים והתקדמות ההצטברות לאורך זמן כפי שנצפה תוך 24, 48 ו-72 שעות.

הצטברות השומנים ביחס למספר התאים כומתה באמצעות כתמי שומנים ודנ"א. גם הצטברות השומנים וגם התפשטות התאים גדלו עם הזמן. ניתן לראות מספר תאים נמוך או תאים פגומים כאשר שברי הרקמה מתעכלים זמן רב מדי.

לכן, מומלץ כי שעה וחצי של עיכול הוא לא יעלה. פראדיפוציטים מבודדים יכולים לשמש למחקרי ביטוי גנים. ניתן להשיג מספיק RNA לשימוש בסינתזת cDNA ומעקב אחר qPCR או RNAseq.