ברצוננו להודות הטכנולוגיה במעבדה של מרפאת מאיו Mycobacteriology מעבדה על עזרתם במהלך המחקר.

כל מעבדה זקוקה כדי לבצע הערכת סיכונים תוך שיתוף פעולה עם קצין בטיחות ביולוגית המוסדיים שלהם כדי לקבוע את הרמה המתאימה biosafety להכנת inoculum ועל pipetting של inoculum לתוך הצלחת. במעבדה שלנו, אנו מנצלים רמת biosafety 3 מעבדה (BSL3) נוהלי עד צלחות microtiter הם מחוסן, וחתום בחותמת דבק פלסטי. הצלחות אלה ממוקמות ואז בתוך שקית ניילון, אשר חתום גם חום. דגירה ופרשנות קריאה הצלחת microtiter מתנהל 2 רמת biosafety מעבדה (BSL2). 1. תיוג של חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל דם צלחת אגר, שלושה מידלברוק 7H10 צלחות, מידלברוק 7H9 מרק, מלח tween שפופרת זכוכית חרוז וצלחת AST microtiter עם מזהים המתאים (למשל, שם החולה, מספר רשומה רפואית) ב BSL2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית אגר דם 7H10 מצופה כמו &quot;לבדוק את טוהר&quot;. ספירות תקופתיות של המושבה inoculum מומלץ לוודא כי ריכוז מתאים של אורגניזמים משמש הבדיקה. ספירת המושבה לבצע כאשר צריך לעבור שתי צלחות 7H10 שכותרתו עם &quot;לספור 1 / 1 המושבה&quot; ו &quot;לספור 1 / 50 המושבה&quot;. </li></ol> 2. טכנולוג ההכנות להיכנס BSL3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד מגן אישי מתאים יש צורך לעבוד BSL3 וכולל מוצק מול חלוק, כיסוי ראש, כפפות, כיסויי נעליים, ומכשיר הנשמה. כל מוסד צריך להקים תוכנית להגנה על דרכי הנשימה שלהם בשיתוף פעולה עם קצין היגיינה תעשייתי במוסד שלהם. במעבדה שלנו, יש לנו כמה הנשמה זמין, כולל מופעל טיהור הנשמה אוויר (PAPRs) והתאים-HEPA מסונן, חצי פנים מסכת N95. </li></ol> 3. הכנת הארון בטיחות ביולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב BSL3, להכין את ארון הבטיחות הביולוגית (BSC) על ידי חיטוי את פני השטח הנחת מגבת נייר ספוגה כ 6 אינץ&#39; חיטוי מהלוח פתח האוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיכל פסולת בצד שמאל, ו nephlometer vortexer קטן בצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לולאות inoculating, pipetors וטיפים ממוקמים ליד מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מתלה עם האורגניזם (במרק או בינוני מוצק) ורמת 0.5 מק &#39;פרלנד על מגבת נייר. </li></ol> 4. כיול nephelometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שפופרת זכוכית מלוחים tween חרוז nephelometer ולהגדיר את המכשיר לאפס באמצעות ריק מלוחים tween. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תקן 0.5 מק &#39;פרלנד ב nephelometer ו לכייל בהתאם להוראות היצרן. </li></ol> 5. הכנת Inoculum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה, מושבות BSC לגרד ממדיום מוצק באמצעות לולאה סטרילי לתוך שכותרתו כראוי מלוחים צינור tween חרוז זכוכית עד ≥ 0.5 מק &#39;פרלנד רגיל מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את המדגם, ולהשוות את תקן מק &#39;פרלנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס מדגם עבור 30-60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר inoculum להתיישב במשך 15 דקות (הגדרת טיימר). </li></ol> 6. הרכבה של הצלחת microtiter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את inoculum עם מרק tween מלוחים באמצעות nephelometer מכויל על מק &#39;פרלנד 0.5 צעדים 4.1 ו 4.2. זה חייב להסתיים תוך 30 דקות (לפי מפרט היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetter 200 μL ו אירוסול ארוך עמיד pipet קצה להסיר 100 μL של inoculum מ rd 1 / 3 העליון של צינור מלוחים tween חרוז. לחסן את התבשיל 7H9 מידלברוק. לאט לאט מערבולת מרק 7H9 מחוסן למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת microtiter AST מהחבילה של היצרן. אין להשתמש אם יבוש הוא כחול או אם חבילת נייר פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורית 1:50 דילול לשימוש מאוחר יותר בהכנת דילול 01:50 על ידי pipetting 50 μL של מים סטריליים לתוך צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצקת את המרק inoculum 7H9 לתוך שוקת. למניעת יצירת אירוסולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת microtiter AST עם התווית פונה אליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetter 12 ערוצים להוסיף 100 μL של inoculum אל היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים עבור מונה המושבה: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול 1 / 1 מוכן משליטת חיובי היטב (H12) על ידי פסים 1 לולאה μl על הצלחת 7H10 שכותרתו &quot;01/01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול 1 / 50 הוא הוכן על ידי inoculating לולאה 1 μl משליטת חיובי היטב (H12) ו מתערבל אותו לתוך הצינור עם 50 μl של צינור מים מוכן לעיל. 1 Streak μL של דילול זו הצלחת שכותרתו &quot;1 / 50&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את הצלחות טוהר מן השוקת על ידי pipetting 50 μL על אגר דם שכותרתו הולם צלחת 7H10 ותגרום לבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקוםחותם דבק על הצלחת microtiter AST. לחץ בחוזקה על כל היטב כדי להבטיח איטום הולם באמצעות גב לבן של החותם. הימנע קמטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הצלחת microtiter ידי מנגב אותו עם מגבת נייר ספוגה בחומר חיטוי tuberculocidal ו microtiter צלחת מקום בתוך שקית פלסטיק עם קרוב חותם חום או קלטת. <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקית הניילון משמשת מיכל המשני על מנת להבטיח כי כל מרק הוא הכיל לא אמורה להיות דליפה או לשפוך הצלחת העיקרית. </li></ol></li></ol> 7. חיטוי של חומרים ארון בטיחות ביולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע ייצור אירוסולים, למקום אחר שוקת על גבי השוקת מחוסן לפני הצבת אותו בעדינות לתוך המיכל וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את כל החומרים כולל nephlometer, vortexer, צלחות, צינורות, וכו &#39;על ידי וניגבתי חיטוי tuberculocidal ולחכות את הזמן המתאים כדי להבטיח חיטוי על פי הוראות היצרן לפני הסרת מן BSC. לדוגמה, Prospray, חיטוי tuberculocidal אנו משתמשים, דורש 15 דקות כדי להרוג mycobacteria. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מיכל להשליך בשקית Biohazard חותם ולפני מעוקר. </li></ol> 8. דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות צריך להיות מודגרות עם התקשורת למטה יש להיזהר כדי למנוע שפיכת כל נוזל או התזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת microtiter AST צלחת, 7H10 ו צלחות אגר דם 35-37 מעלות צלזיוס עם חממה CO 2 עם 5-10% 5-10% CO 2 במעבדה BSL2. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במעבדה שלנו, זה מקובל, כי הצלחת היטב אטום בתוך שקית ניילון סגורה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא יותר מ 2 צלחות microtiter AST צריך להערם בחממה על פי הוראות היצרן. </li></ol> 9. נציג תוצאות פרשנות של תוצאות: אטום AST צלחות microtiter ניתן לקרוא באופן ידני באמצעות מראה כעזר או עם קורא צלחת אוטומטי כגון Vizion (TREK באבחון). הצלחות ניתן לבחון בהקדם 7 ימים לאחר חיסון. בדוק את בקרת צמיחה בארות בעמדות H11 ו H12 כדי לקבוע אם הם חיובי (כלומר, יש הפקדה של תאים בתחתית הבאר). אם הפקד בארות צמיחה לא חיובית, reincubate את הצלחת לבחון מחדש מעת לעת (למשל, יום 10, יום 14) עד בקרת בארות הצמיחה הן חיוביות. <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מירור נכתב: <ol type="i" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום אטום צלחת AST microtiter לבמה; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקריאה מלאה בארות צמיחה לאחר 7 ימים של דגירה, אם זה שלילי, reincubate צלחת AST microtiter; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פקדי צמיחה מקובלים, ולאחר מכן קרא את התרופה המכילים בארות. עבור לכל תרופה, הרשומה דילול הראשונה אין צמיחה על ידי השוואת בארות התרופה עם שליטה הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחה מופיעה עכירות או הפקדה של תאים בתחתית באר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי קריאה: בצע את ההוראות יצרני; את ההוראות להלן דוגמה לאופן הקריאה ייעשה עם פלטפורמת Vizion: <ol type="i" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסה פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;MYCOTB&quot; תוכנה AST צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת עם ברקוד אטומה מול המשתמש. צמיחה מופיעה עכירות או הפקדה של תאים בתחתית באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו שולטת צמיחה, אם זה שלילי, reincubate צלחת AST microtiter, אם חיובי לקרוא את הצלחת על ידי נגיעה במסך עם טוב הראשון של כל תרופה שאינה להראות צמיחה. </li></ol></li></ol> קראו צלחות טוהר. צלחת אגר דם לא צריך להראות צמיחה לאחר 48 שעות את הצלחת טוהר 7H10 צריך צמיחה ומחוברות סוג של אורגניזם אחד. אם מזוהמים, המבחן microtiter AST צריך להיות חזר מתרבות טהור. חישוב ספירת המושבה משליטת חיובי גם באמצעות הטבלה שלהלן: הרוזן המושבה מפתח <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מושבות # מנה על צלחת שכותרתו &quot;01/01&quot; </td><td> מושבות # מנה על צלחת שכותרתו &quot;1 / 50&quot; </td><td> Inoculum הרוזן המושבה (CFU / mL) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X אוקטובר 04-01 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X אוקטובר 05-05 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> אולי יש נגרר עם חומצה פארה-aminosalicylic כמה זנים של Mycobacterium tuberculoאחותי. זה יכול להתפרש על ידי הסתכלות כל הבארות, כי יש כדוריות ושימוש הבאר הראשונה כי יש גלולה בגודל זהה דילול הבאה כנקודת סיום. ההתנגדות היא נדירה עם התרופה הזו. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. נציג התוצאות באמצעות צלחת MYCOTB. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרופות קיצור </td><td> תרופה </td><td> MIC μ / mL </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Mxf </td><td> moxifloxacin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> עמי </td><td> amikacin </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> סטרפטומיצין </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-aminosalicylic חומצה </td><td> ≤ 0.5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> ethionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Cyc </td><td> cycloserine </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazid </td><td> 2 </td></tr><tr><td> קן </td><td> kanamycin </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> ethambutol </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+New+Sensititre+(MYCOTB)+MIC+Plate+for+the+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis+(Mtb)+to+First+and+Second+Line+Drugs.">Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs.</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HHS+Publication+No.+(CDC)+21-112:+Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories+(BMBL).">HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL).</a> U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , (2009).</li><li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing.">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li><li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+the+MB/BACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENSITITRE+MYCOTB+Susceptibility+Plate:+For+Mycobacterium+Susceptibility+Testing.">SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing.</a> Product Insert. , (2010).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , (2003).</li><li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+results+from+a+new+TREK+Sensititre+Mycobacterium+tuberculosis+MIC+plate+(MYCOTB).">Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB).</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VersaTREK+MYCO+SUSCEPTIBLITY+KIT.">VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT.</a> Product insert. , 7115-7160 (2008).</li><li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings.">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , (2010).</li><li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance.">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li><li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B., Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+Test+Methods:+Mycobacteria,+Nocardia,+and+Other+Actinomycetes.">Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1223-1247 (2007).</li><li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs.">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li></ol>

דוגמה צלחת microtiter AST אשר שולטת צמיחה חיובית מוצג באיור 1 ו MIC נקודת קצה (מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור כל תרופה היא הקיפה. מחקר שנערך במעבדה שלנו ציינו כי שיטת צלחת AST microtiter שווה את השיטה אגר תקן הזהב שיעור לבדיקות הרגישות של שחפת Mycobacterium. דיווח מהיר יותר של תוצאות הושג עם צלחת microtiter microtiter AST לעומת השיטה המסורתית פרופורציה אגר עם הפרשנות הסופית צלחת microtiter AST ו - פרופורציה שיטה אגר ב 14 ו 21 ימים, respectively.The צלחת AST microtiter יש את היתרון של הבדיקה הראשונה קו תרופות second בו זמנית אשר יכול לעזור למנוע עיכובים מופרזת עם זנים עמידים. צלחת microtiter AST הוא גם הרבה יותר קל להגדיר מאשר לקרוא APM ושניהם מראה ידנית ומערכת חצי אוטומטי כגון VIZION ניתן להשתמש כדי לקרוא את הצלחות. הזמינות של ערך MIC עבור בדיקות סמים TB התנגדות עשוי לספק מידע חדש בעל ערך לרופאים יחסית לערך ריכוז המסורתית קריטי, במיוחד עבור אלה מבודד עם רגישות &quot;גבולי&quot;.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> AST microtiter צלחות חותם דבק </td><td> TREK אבחון, קליבלנד אוהיו </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> מק &#39;פרלנד 0.5 תקן </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> מידלברוק 7H10 צלחות </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> פלטות אגר דם </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי לולאות 1 μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> לולאות סטרילי 10 μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween חרוז זכוכית מרק </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC מרק </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Pipet טיפים לונג </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי שקתות </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td></td></tr><tr><td> מ שחפת </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> טיפים 1000, 20, 20 μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> רב Pipetter </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> החממה CO% 05-10 פבואר </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> שקיות פלסטיק, קטנה, CO 2 חדיר </td><td> פולי פלסטיק, דלאנו, הרשות הפלסטינית </td><td></td></tr><tr><td> חיטוי שחפת (כגון ProSpray C-60) </td><td> Certol הבינלאומי, המסחר סיטי, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> מראה תיבת Reader </td><td> דיג </td><td></td></tr></tbody></table>

antimicrobial susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis complex for first and second line drugs by broth dilution in a microtiter plate format

איתור מהיר של עמידות מיקרוביאלית חשוב במאמץ לשלוט על הגידול עמידים Mycobacterium tuberculosis (MTB). בדיקות רגישות Antimicrobial (AST) של MTB באופן מסורתי בוצעו בשיטה אגר פרופורציה או על ידי בדיקות macrobroth על מכשיר כמו BACTEC (בקטון דיקינסון, ניצוצות, MD), VersaTREK (TREK אבחון, קליבלנד, OH) או BacT / התראה (bioMérieux, הייזלווד, MO). שיטת שיעור אגר, בעוד נחשב סטנדרטי &quot;זהב&quot; של AST, הוא עבודה אינטנסיבית ודורשת חישוב התנגדות על ידי ביצוע ספירת המושבה על אגר סמים המכילים לעומת אגר נקי מסמים. אם יש ≥ צמיחה של 1% על מדיום המכיל את התרופה לעומת בינוני התרופה ללא תשלום, האורגניזם נחשב עמידות לתרופה זו. שיטות macrobroth דורשות מכשור לשבור נקודת מבחן (&quot;קריטי&quot;) ריכוזי התרופה עבור תרופות הקו הראשון (isoniazid, ethambutol, rifampin ו pyrazinamide). השיטה המתוארת כאן זמין מסחרית בתבנית 96 microtiter גם צלחת [MYCOTB (TREK באבחון)] והוא מכיל ריכוז גדל והולך של 12 antimicrobials משמש לטיפול בשחפת כולל שני הראשונים (isoniazid, rifampin, ethambutol) תרופות הקו השני (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic חומצה, rifabutin, וסטרפטומיצין). Pyrazinamide, תרופה השורה הראשונה, לא נכלל הצלחת microtiter בשל הצורך שלה התנאים מבחן חומצי. היתרונות של מערכת microtiter לכלול הן קלות להגדיר להפוך מהר יותר סביב זמן (14 ימים), לעומת שיעור אגר המסורתיים (21 ימים). בנוסף, הצלחת ניתן להגדיר מ inoculum מוכן שימוש או מרק או בינוני מוצק. מאז הפורמט צלחת microtiter הוא חדש מאז MTB מציב אתגרים ייחודיים בטיחות במעבדה, פרוטוקול זה יתאר כיצד בבטחה ההתקנה, דגירה ולקרוא את הצלחת microtiter.

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format at J

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

בדיקות רגישות Antimicrobial של Mycobacterium tuberculosis מאתגרת אך קריטי עבור הטיפול בחולה. מתכונת זו צלחת microtiter מציע בדיקה של 12 תרופות antimycobacterial ומספק ריכוז מעכבות המינימלי (MIC) ערכים, אשר יסייע הטיפול המתאים.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.0K Views.  Mayo Clinic. בדיקות רגישות Antimicrobial של Mycobacterium tuberculosis מאתגרת אך קריטי עבור הטיפול בחולה. מתכונת זו צלחת microtiter מציע בדיקה של 12 תרופות antimycobacterial ומספק ריכוז מעכבות המינימלי (MIC) ערכים, אשר יסייע הטיפול המתאים.

Video: Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...