ברצוננו להודות הטכנולוגיה במעבדה של מרפאת מאיו Mycobacteriology מעבדה על עזרתם במהלך המחקר.

כל מעבדה זקוקה כדי לבצע הערכת סיכונים תוך שיתוף פעולה עם קצין בטיחות ביולוגית המוסדיים שלהם כדי לקבוע את הרמה המתאימה biosafety להכנת inoculum ועל pipetting של inoculum לתוך הצלחת. במעבדה שלנו, אנו מנצלים רמת biosafety 3 מעבדה (BSL3) נוהלי עד צלחות microtiter הם מחוסן, וחתום בחותמת דבק פלסטי. הצלחות אלה ממוקמות ואז בתוך שקית ניילון, אשר חתום גם חום. דגירה ופרשנות קריאה הצלחת microtiter מתנהל 2 רמת biosafety מעבדה (BSL2). 1. תיוג של חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל דם צלחת אגר, שלושה מידלברוק 7H10 צלחות, מידלברוק 7H9 מרק, מלח tween שפופרת זכוכית חרוז וצלחת AST microtiter עם מזהים המתאים (למשל, שם החולה, מספר רשומה רפואית) ב BSL2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית אגר דם 7H10 מצופה כמו &quot;לבדוק את טוהר&quot;. ספירות תקופתיות של המושבה inoculum מומלץ לוודא כי ריכוז מתאים של אורגניזמים משמש הבדיקה. ספירת המושבה לבצע כאשר צריך לעבור שתי צלחות 7H10 שכותרתו עם &quot;לספור 1 / 1 המושבה&quot; ו &quot;לספור 1 / 50 המושבה&quot;. </li></ol> 2. טכנולוג ההכנות להיכנס BSL3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד מגן אישי מתאים יש צורך לעבוד BSL3 וכולל מוצק מול חלוק, כיסוי ראש, כפפות, כיסויי נעליים, ומכשיר הנשמה. כל מוסד צריך להקים תוכנית להגנה על דרכי הנשימה שלהם בשיתוף פעולה עם קצין היגיינה תעשייתי במוסד שלהם. במעבדה שלנו, יש לנו כמה הנשמה זמין, כולל מופעל טיהור הנשמה אוויר (PAPRs) והתאים-HEPA מסונן, חצי פנים מסכת N95. </li></ol> 3. הכנת הארון בטיחות ביולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב BSL3, להכין את ארון הבטיחות הביולוגית (BSC) על ידי חיטוי את פני השטח הנחת מגבת נייר ספוגה כ 6 אינץ&#39; חיטוי מהלוח פתח האוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיכל פסולת בצד שמאל, ו nephlometer vortexer קטן בצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לולאות inoculating, pipetors וטיפים ממוקמים ליד מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מתלה עם האורגניזם (במרק או בינוני מוצק) ורמת 0.5 מק &#39;פרלנד על מגבת נייר. </li></ol> 4. כיול nephelometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שפופרת זכוכית מלוחים tween חרוז nephelometer ולהגדיר את המכשיר לאפס באמצעות ריק מלוחים tween. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תקן 0.5 מק &#39;פרלנד ב nephelometer ו לכייל בהתאם להוראות היצרן. </li></ol> 5. הכנת Inoculum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה, מושבות BSC לגרד ממדיום מוצק באמצעות לולאה סטרילי לתוך שכותרתו כראוי מלוחים צינור tween חרוז זכוכית עד ≥ 0.5 מק &#39;פרלנד רגיל מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את המדגם, ולהשוות את תקן מק &#39;פרלנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס מדגם עבור 30-60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר inoculum להתיישב במשך 15 דקות (הגדרת טיימר). </li></ol> 6. הרכבה של הצלחת microtiter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את inoculum עם מרק tween מלוחים באמצעות nephelometer מכויל על מק &#39;פרלנד 0.5 צעדים 4.1 ו 4.2. זה חייב להסתיים תוך 30 דקות (לפי מפרט היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetter 200 μL ו אירוסול ארוך עמיד pipet קצה להסיר 100 μL של inoculum מ rd 1 / 3 העליון של צינור מלוחים tween חרוז. לחסן את התבשיל 7H9 מידלברוק. לאט לאט מערבולת מרק 7H9 מחוסן למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת microtiter AST מהחבילה של היצרן. אין להשתמש אם יבוש הוא כחול או אם חבילת נייר פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורית 1:50 דילול לשימוש מאוחר יותר בהכנת דילול 01:50 על ידי pipetting 50 μL של מים סטריליים לתוך צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצקת את המרק inoculum 7H9 לתוך שוקת. למניעת יצירת אירוסולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת microtiter AST עם התווית פונה אליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetter 12 ערוצים להוסיף 100 μL של inoculum אל היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים עבור מונה המושבה: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול 1 / 1 מוכן משליטת חיובי היטב (H12) על ידי פסים 1 לולאה μl על הצלחת 7H10 שכותרתו &quot;01/01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול 1 / 50 הוא הוכן על ידי inoculating לולאה 1 μl משליטת חיובי היטב (H12) ו מתערבל אותו לתוך הצינור עם 50 μl של צינור מים מוכן לעיל. 1 Streak μL של דילול זו הצלחת שכותרתו &quot;1 / 50&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את הצלחות טוהר מן השוקת על ידי pipetting 50 μL על אגר דם שכותרתו הולם צלחת 7H10 ותגרום לבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקוםחותם דבק על הצלחת microtiter AST. לחץ בחוזקה על כל היטב כדי להבטיח איטום הולם באמצעות גב לבן של החותם. הימנע קמטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הצלחת microtiter ידי מנגב אותו עם מגבת נייר ספוגה בחומר חיטוי tuberculocidal ו microtiter צלחת מקום בתוך שקית פלסטיק עם קרוב חותם חום או קלטת. <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקית הניילון משמשת מיכל המשני על מנת להבטיח כי כל מרק הוא הכיל לא אמורה להיות דליפה או לשפוך הצלחת העיקרית. </li></ol></li></ol> 7. חיטוי של חומרים ארון בטיחות ביולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע ייצור אירוסולים, למקום אחר שוקת על גבי השוקת מחוסן לפני הצבת אותו בעדינות לתוך המיכל וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את כל החומרים כולל nephlometer, vortexer, צלחות, צינורות, וכו &#39;על ידי וניגבתי חיטוי tuberculocidal ולחכות את הזמן המתאים כדי להבטיח חיטוי על פי הוראות היצרן לפני הסרת מן BSC. לדוגמה, Prospray, חיטוי tuberculocidal אנו משתמשים, דורש 15 דקות כדי להרוג mycobacteria. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מיכל להשליך בשקית Biohazard חותם ולפני מעוקר. </li></ol> 8. דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות צריך להיות מודגרות עם התקשורת למטה יש להיזהר כדי למנוע שפיכת כל נוזל או התזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת microtiter AST צלחת, 7H10 ו צלחות אגר דם 35-37 מעלות צלזיוס עם חממה CO 2 עם 5-10% 5-10% CO 2 במעבדה BSL2. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במעבדה שלנו, זה מקובל, כי הצלחת היטב אטום בתוך שקית ניילון סגורה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא יותר מ 2 צלחות microtiter AST צריך להערם בחממה על פי הוראות היצרן. </li></ol> 9. נציג תוצאות פרשנות של תוצאות: אטום AST צלחות microtiter ניתן לקרוא באופן ידני באמצעות מראה כעזר או עם קורא צלחת אוטומטי כגון Vizion (TREK באבחון). הצלחות ניתן לבחון בהקדם 7 ימים לאחר חיסון. בדוק את בקרת צמיחה בארות בעמדות H11 ו H12 כדי לקבוע אם הם חיובי (כלומר, יש הפקדה של תאים בתחתית הבאר). אם הפקד בארות צמיחה לא חיובית, reincubate את הצלחת לבחון מחדש מעת לעת (למשל, יום 10, יום 14) עד בקרת בארות הצמיחה הן חיוביות. <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מירור נכתב: <ol type="i" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום אטום צלחת AST microtiter לבמה; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקריאה מלאה בארות צמיחה לאחר 7 ימים של דגירה, אם זה שלילי, reincubate צלחת AST microtiter; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פקדי צמיחה מקובלים, ולאחר מכן קרא את התרופה המכילים בארות. עבור לכל תרופה, הרשומה דילול הראשונה אין צמיחה על ידי השוואת בארות התרופה עם שליטה הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחה מופיעה עכירות או הפקדה של תאים בתחתית באר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי קריאה: בצע את ההוראות יצרני; את ההוראות להלן דוגמה לאופן הקריאה ייעשה עם פלטפורמת Vizion: <ol type="i" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסה פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;MYCOTB&quot; תוכנה AST צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת עם ברקוד אטומה מול המשתמש. צמיחה מופיעה עכירות או הפקדה של תאים בתחתית באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו שולטת צמיחה, אם זה שלילי, reincubate צלחת AST microtiter, אם חיובי לקרוא את הצלחת על ידי נגיעה במסך עם טוב הראשון של כל תרופה שאינה להראות צמיחה. </li></ol></li></ol> קראו צלחות טוהר. צלחת אגר דם לא צריך להראות צמיחה לאחר 48 שעות את הצלחת טוהר 7H10 צריך צמיחה ומחוברות סוג של אורגניזם אחד. אם מזוהמים, המבחן microtiter AST צריך להיות חזר מתרבות טהור. חישוב ספירת המושבה משליטת חיובי גם באמצעות הטבלה שלהלן: הרוזן המושבה מפתח <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מושבות # מנה על צלחת שכותרתו &quot;01/01&quot; </td><td> מושבות # מנה על צלחת שכותרתו &quot;1 / 50&quot; </td><td> Inoculum הרוזן המושבה (CFU / mL) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X אוקטובר 04-01 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X אוקטובר 05-05 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> אולי יש נגרר עם חומצה פארה-aminosalicylic כמה זנים של Mycobacterium tuberculoאחותי. זה יכול להתפרש על ידי הסתכלות כל הבארות, כי יש כדוריות ושימוש הבאר הראשונה כי יש גלולה בגודל זהה דילול הבאה כנקודת סיום. ההתנגדות היא נדירה עם התרופה הזו. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. נציג התוצאות באמצעות צלחת MYCOTB. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרופות קיצור </td><td> תרופה </td><td> MIC μ / mL </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Mxf </td><td> moxifloxacin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> עמי </td><td> amikacin </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> סטרפטומיצין </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-aminosalicylic חומצה </td><td> ≤ 0.5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> ethionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Cyc </td><td> cycloserine </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazid </td><td> 2 </td></tr><tr><td> קן </td><td> kanamycin </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> ethambutol </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+New+Sensititre+(MYCOTB)+MIC+Plate+for+the+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis+(Mtb)+to+First+and+Second+Line+Drugs.">Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs.</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HHS+Publication+No.+(CDC)+21-112:+Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories+(BMBL).">HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL).</a> U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , (2009).</li><li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing.">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li><li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+the+MB/BACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENSITITRE+MYCOTB+Susceptibility+Plate:+For+Mycobacterium+Susceptibility+Testing.">SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing.</a> Product Insert. , (2010).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , (2003).</li><li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+results+from+a+new+TREK+Sensititre+Mycobacterium+tuberculosis+MIC+plate+(MYCOTB).">Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB).</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VersaTREK+MYCO+SUSCEPTIBLITY+KIT.">VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT.</a> Product insert. , 7115-7160 (2008).</li><li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings.">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , (2010).</li><li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance.">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li><li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B., Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+Test+Methods:+Mycobacteria,+Nocardia,+and+Other+Actinomycetes.">Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1223-1247 (2007).</li><li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs.">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li></ol>

דוגמה צלחת microtiter AST אשר שולטת צמיחה חיובית מוצג באיור 1 ו MIC נקודת קצה (מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור כל תרופה היא הקיפה. מחקר שנערך במעבדה שלנו ציינו כי שיטת צלחת AST microtiter שווה את השיטה אגר תקן הזהב שיעור לבדיקות הרגישות של שחפת Mycobacterium. דיווח מהיר יותר של תוצאות הושג עם צלחת microtiter microtiter AST לעומת השיטה המסורתית פרופורציה אגר עם הפרשנות הסופית צלחת microtiter AST ו - פרופורציה שיטה אגר ב 14 ו 21 ימים, respectively.The צלחת AST microtiter יש את היתרון של הבדיקה הראשונה קו תרופות second בו זמנית אשר יכול לעזור למנוע עיכובים מופרזת עם זנים עמידים. צלחת microtiter AST הוא גם הרבה יותר קל להגדיר מאשר לקרוא APM ושניהם מראה ידנית ומערכת חצי אוטומטי כגון VIZION ניתן להשתמש כדי לקרוא את הצלחות. הזמינות של ערך MIC עבור בדיקות סמים TB התנגדות עשוי לספק מידע חדש בעל ערך לרופאים יחסית לערך ריכוז המסורתית קריטי, במיוחד עבור אלה מבודד עם רגישות &quot;גבולי&quot;.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> AST microtiter צלחות חותם דבק </td><td> TREK אבחון, קליבלנד אוהיו </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> מק &#39;פרלנד 0.5 תקן </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> מידלברוק 7H10 צלחות </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> פלטות אגר דם </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי לולאות 1 μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> לולאות סטרילי 10 μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween חרוז זכוכית מרק </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC מרק </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Pipet טיפים לונג </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי שקתות </td><td> TREK אבחון, קליבלנד, אוהיו </td><td></td></tr><tr><td> מ שחפת </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> טיפים 1000, 20, 20 μL </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> רב Pipetter </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> החממה CO% 05-10 פבואר </td><td> דיג </td><td></td></tr><tr><td> שקיות פלסטיק, קטנה, CO 2 חדיר </td><td> פולי פלסטיק, דלאנו, הרשות הפלסטינית </td><td></td></tr><tr><td> חיטוי שחפת (כגון ProSpray C-60) </td><td> Certol הבינלאומי, המסחר סיטי, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> מראה תיבת Reader </td><td> דיג </td><td></td></tr></tbody></table>

antimicrobial susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis complex for first and second line drugs by broth dilution in a microtiter plate format

איתור מהיר של עמידות מיקרוביאלית חשוב במאמץ לשלוט על הגידול עמידים Mycobacterium tuberculosis (MTB). בדיקות רגישות Antimicrobial (AST) של MTB באופן מסורתי בוצעו בשיטה אגר פרופורציה או על ידי בדיקות macrobroth על מכשיר כמו BACTEC (בקטון דיקינסון, ניצוצות, MD), VersaTREK (TREK אבחון, קליבלנד, OH) או BacT / התראה (bioMérieux, הייזלווד, MO). שיטת שיעור אגר, בעוד נחשב סטנדרטי &quot;זהב&quot; של AST, הוא עבודה אינטנסיבית ודורשת חישוב התנגדות על ידי ביצוע ספירת המושבה על אגר סמים המכילים לעומת אגר נקי מסמים. אם יש ≥ צמיחה של 1% על מדיום המכיל את התרופה לעומת בינוני התרופה ללא תשלום, האורגניזם נחשב עמידות לתרופה זו. שיטות macrobroth דורשות מכשור לשבור נקודת מבחן (&quot;קריטי&quot;) ריכוזי התרופה עבור תרופות הקו הראשון (isoniazid, ethambutol, rifampin ו pyrazinamide). השיטה המתוארת כאן זמין מסחרית בתבנית 96 microtiter גם צלחת [MYCOTB (TREK באבחון)] והוא מכיל ריכוז גדל והולך של 12 antimicrobials משמש לטיפול בשחפת כולל שני הראשונים (isoniazid, rifampin, ethambutol) תרופות הקו השני (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic חומצה, rifabutin, וסטרפטומיצין). Pyrazinamide, תרופה השורה הראשונה, לא נכלל הצלחת microtiter בשל הצורך שלה התנאים מבחן חומצי. היתרונות של מערכת microtiter לכלול הן קלות להגדיר להפוך מהר יותר סביב זמן (14 ימים), לעומת שיעור אגר המסורתיים (21 ימים). בנוסף, הצלחת ניתן להגדיר מ inoculum מוכן שימוש או מרק או בינוני מוצק. מאז הפורמט צלחת microtiter הוא חדש מאז MTB מציב אתגרים ייחודיים בטיחות במעבדה, פרוטוקול זה יתאר כיצד בבטחה ההתקנה, דגירה ולקרוא את הצלחת microtiter.

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format at J

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

בדיקות רגישות Antimicrobial של Mycobacterium tuberculosis מאתגרת אך קריטי עבור הטיפול בחולה. מתכונת זו צלחת microtiter מציע בדיקה של 12 תרופות antimycobacterial ומספק ריכוז מעכבות המינימלי (MIC) ערכים, אשר יסייע הטיפול המתאים.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.1K Views.  Mayo Clinic. בדיקות רגישות Antimicrobial של Mycobacterium tuberculosis מאתגרת אך קריטי עבור הטיפול בחולה. מתכונת זו צלחת microtiter מציע בדיקה של 12 תרופות antimycobacterial ומספק ריכוז מעכבות המינימלי (MIC) ערכים, אשר יסייע הטיפול המתאים.

Video: Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Biology

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקת סינון בתפוקה גבוהה עבור Mycobacterium abscessus באמצעות כתבים כפולים

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: Scalable Drug Screening Protocol for Efficient Discovery of M . abscessus Therapies

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

הוכחת סמים רבים עמידים

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה