ברצוננו להודות שון Fitzwater וכרמן Giannina לונה קולומבו עבור קטע וידאו צמיחה שחפת זמן לשגות. אנו מודים מרטי רופר על המשוב יסודי מעולה שלה במהלך העריכה עריכה משותפת המדריך למשתמש, שממנו פרוטוקול הנוכחי נלקח בעיקר מילה במילה. הפקת וידאו זה מומן על ידי NIH / פוגארטי המרכז הבינלאומי <a href="http://www.fic.nih.gov/">http://www.fic.nih.gov/</a> דוד AJ מור תרם כמו עמית מחקר Wellcome Trust קליניים ברפואה Reader טרופי ועל מחלות זיהומיות באימפריאל קולג&#39; בלונדון (Fellowship פרס מספר 078067/Z/05). מארק פ בריידי תרמו כמו עמית NIH / פוגארטי מרכז המחקר הבינלאומי.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט חיץ מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 950ml של תמיסת נתרן dibasic (9.47g של dibasic סודיום פוספט מומס במים מזוקקים 1000ml) עם 950ml של תמיסת אשלגן זרחתי monobasic (9.07g של פוספט monobasic אשלגן מומס במים מזוקקים 1000ml) ומערבבים; לשמור על הגב של 50 מ&quot;ל כל פתרון כדי להתאים pH במידת הצורך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל-pH 6.8 ± 0.2: להוסיף נתרן זרחתי פתרון dibasic להעלות pH; להוסיף פתרון פוספט אשלגן monobasic ל-pH נמוך יותר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי על 121-124 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לעקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת aliquot 100μl הפתרון פוספט חיץ על מדיום אגר מזין בצלחת פטרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לאשר עקרות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן במקרר ב 2-8 מעלות עד חודש הערה: כל דגימת כיח דורש 10 מ&quot;ל של תמיסת חיץ פוספט </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כרכים שווה של פתרון סודיום הידרוקסיד (8.0g של סודיום הידרוקסיד מומס במים מזוקקים 200 מ&quot;ל סטרילי) ו ציטראט פתרון נתרן (סודיום ציטרט 5.8g של מים מזוקקים 200 מ&quot;ל מזוקקים סטריליים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים החיטוי על 121-124 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן במקרר ב 2-8 מעלות עד חודש הערה: כל דגימת כיח דורש 2ml של המניה טיהור </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מניות התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Into 900ml של מים מזוקקים סטריליים להוסיף 3.1ml של גליצרול 1.25g של casitone ו 5.9g של אבקת בינוני 7H9, לערבב עם תסיסה מתמדת עד נמס לגמרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי על 121-124 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב ולחלק את המדיום סטרילי לתוך aliquots 4.5ml ב סטרילי 16x 100 מ&quot;מ צינורות זכוכית להכנת המדגם, 10.8ml aliquots להכנת פתרונות אנטיביוטית בקרות פנימיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לוודא סטריליות (חוסר עכירות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 2-8 ° C עם מכסה סגור היטב עד חודש הערה: כל דגימת כיח דורש אחד שפופרת המכילה 4.5ml של המדיום 7H9 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות פתרונות לאנטיביוטיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א Isoniazid מניות (8 מ&quot;ג / מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 20 מ&quot;ג isoniazid לחלוטין במים מזוקקים 2.5ml סטרילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון עם מסנן מזרק 0.2μm עבור ממס מימית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן aliquots 20μl ב סטרילי צינורות צנטריפוגה מיקרו ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים הערה: כל aliquot 20μl מאוחסנים מספיקה עד 100 דגימות (כולל בזבוז) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב ריפמפיצין מניות (8 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים ריפמפיצין 20mg לחלוטין 1.25ml DMSO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.25ml מים מזוקקים לערבב סטרילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון עם מסנן מזרק 0.2μm עבור ממיס אורגני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן aliquots 20μl צינורות microcentrifuge סטרילי ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים הערה: כל aliquot 20μl מאוחסנים מספיקה עד 100 דגימות (כולל בזבוז) </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות עובד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור עובדים פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.1g של גבישים NALC בכל 20ml של תמיסת טיהור נדרש הערה: כל הצרכים מדגם 2ml של פתרון טיהור הערה: מחק כל פתרון NaOH-NALC טיהור כי נותר ללא שימוש לאחר 24 שעות כמו NALC מאבד פעילות mucolytic לאורך זמן </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת עובדים פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שפופרת עם המדיום 7H9 למדגם כל כיח להיות מעובד, בתוספת 1 שפופרת נוספת עבור כל צלחת (עבור העמודה שליטה שלילי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 צינורות של המדיום 7H9 עבור שולט חיובית (3 אם זנים monoresistant משמשים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 מבחנות עם 7H9 10.8ml להכנת פתרון אנטיביוטי </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5ml OADC כדי 4.5ml של 7H9 בצינור כל המדגם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף OADC 1.2ml לצינורות עם 7H9 10.8ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 2 צינורות עם 5 מ&quot;ל 7H9-OADC עבור פקדי חיובית, שפופרת (ים) עם 12ml 7H9-OADC לשמש להכנת פתרון אנטיביוטיקה (אלה אינם דורשים פנטה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנטה מחדש ולהוסיף 0.1ml אל צינור כל מדגם של צינורות בקרה שלילית (7H9-OADC-פנטה: הנפח הכולל = 5.1ml) הערה: בינוני מלא עם פנטה (7H9-OADC-פנטה) משמש דגימות כיח בקרות שלילי; להשתמש 7H9-OADC ללא פנטה עבור פקדי חיובית להכנת פתרון אנטיביוטי </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות עבודה לאנטיביוטיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1. ראה איור 1 עבור צעדים כדי להפוך את הפתרון עובד אנטיביוטי בצלחת 24-מנוצל היטב הערה: לקבלת התוצאות הרגישות מדויק, הריכוזים אנטיביוטי סופי הן קריטיות. ההליך הבא מתאים laboratories מצויד micropipettes. אם micropipettes אינם זמינים, מזרקים טוברקולין ניתן להשתמש בסדרת שונים של דילולים המתואר במדריך למשתמש נספח 3 ב modsperu.org הערה: אין להקפיא מחדש או שימוש חוזר לעבוד אנטיביוטיקה או פתרונות מניות כפעילות התרופה עלולים ללכת לאיבוד מחק את כל פתרונות אנטיביוטיקה בשימוש בסוף איור עיבוד יום 1.. ביצוע הפתרונות עובדים אנטיביוטי (מתוך מדריך למשתמש ב modsperu.org) </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיח מדגם צלחת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 2ml המדגם כיח לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל (אם פחות, לעשות עד 2ml עם חיץ פוספט, אם יותר, להשתמש רק 2ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml NaOH-NALC פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור שווי בחוזקה מערבולת למשך 20 שניות, להפוך הצינור כדי להבטיח NaOH-NALC המגעים לפתרון כל משטח הפנים של הצינור ואת המכסה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לעמוד על מינימום של 15 דקות - יכול להאריך על ידי כמה דקות אם המדגם הוא צמיגה במיוחד. כדי למנוע את הטיפול, לא יעלה על 20 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצינור כדי 14ml עם חיץ פוספט (pH 6.8) כדי לנטרל אלקלי לסיים את תהליך טיהור, ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך 4 פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3000 גרם במשך 15 דקות (ראה נספח 2 במדריך למשתמש ב modsperu.org עבור המשוואה של סיבובים לדקה צורך להגיע 3000 ז) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצקת את supernatant לתוך מיכל פסולת נוזלית עם hypochlorite נתרן 10% או חומר חיטוי מתאים אחר ולשמר את גלולה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מתלה מדגם גיבוי סופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ב-7H9-OADC פנטה (מהצינור המכיל 5.1ml), resuspend המדגם גלולה בהיקף כולל של 2ml בצינור צנטריפוגה עם פיפטה פסטר, ומערבבים היטב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1ml של השעיה מדגם חנות בתוך שפופרת microcentrifuge ב 2-8 מעלות צלזיוס כגיבוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את 1ml השני של השעיה מדגם הצינור עם הנותרים 7H9-OADC-פנטה, ומערבבים היטב. זהו הפתרון הסופי מדגם מוכן ציפוי </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבת השעיות מדגם לתוך צלחת 24 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 900μl ההשעיה המדגם הסופי לתוך כל אחד 4 בארות של עמודה בצלחת 24 הבאר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם דגימות נוספות עד שכל העמודות של צלחת, למעט טור 3, מלאים (או עד שכל הדגימות מצופה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 900μl של המדיום 7H9-OADC ללא מדגם של 4 הבארות של טור 3 של כל צלחת מדגם (בקרות פנימיות שליליות) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת אנטיביוטיקה דגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טפטפת מרובת ערוצים, 4 טיפים למלא בקפידה עם 100μl מבארות עם פתרונות עובד 7H9-OADC ו אנטיביוטי (טור 2 בדילול אנטיביוטי צלחת ראה תרשים 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את aliquots 100μl ל 1 בארות טור עם פתרונות לדוגמה 900μl בלי לגעת בצלחת או מדגם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עד שכל העמודות קיבלו את 100μl נוסף בינוני (נקי מסמים בארות) או פתרונות אנטיביוטי (כולל עמודה בקרה שלילית 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצלחת עם המכסה ומניחים שקית רב סגר (Ziplock) ניילון וסוגרים (תיק לא נפתח שוב מכאן ואילך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C (CO 2 העשרה לא הכרחי) </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות שליליות הן לרוץ על כל צלחת. נוכחותם של צמיחה כלשהי בכל הבארות בטור הביקורת שלילי מעיד צולבות זיהום, ולכן את הצלחת כולה חייבת להיות מושלך לבין דגימות מחדש מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שולטת חיובית מנוהלות על צלחת נפרדת בסוף היום. אחת מלאה סמים רגישים למתח מנוהלת בעמודה וגם עמידות להתאמץ כדי INH ו RIF מנוהלת בעמודה אחרת. אם קיים חשש לגבי הפעלת הלחץ MDR, הן זן monoresistant INH ו זן RIF monoresistant ניתן להפעיל במקום של זנים רגישים ו - MDR. כל שולטת חיובית צריך הצמיחה מסמים בארות להוכיח כי הצמיחה תמיכה בתקשורת. כדי להדגים כי ריכוזי התרופה נכונים, את המתח רגישים לא צריך לגדול INH או RIF בארות, אבל את המתח MDR צריך לגדול גם לגדול INH ו RIF בארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט קריאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כל יום של ציפוי כמו &quot;יום 0,&quot; קריאה צלחת מתחיל ביום 5, ואם שלילית על יום 5 הקריאה נעשית כל יום (או לסירוגין, תלוי בעומס העבודה) עד 14 יום ולאחר מכן כל 2-3 ימים מיום 15 -21. פלטות נבחנים עלמיקרוסקופ אור הפוכה במטרה 10x </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חיובית היא זו שבה יש שתי יחידות או יותר להרכיב המושבה (&gt; 2 CFU) הן ללא שימוש בסמים בארות. צמיחה mycobacterial מוקדם נראה כמו פסיקים קטן מעוקל או ספירלות (5-9 ימים). הקמת המושבה בדרך כלל מתקדמת כדי &quot;חבלים&quot; או &quot;הקשרים&quot; (ראו תמונה על ספריה modsperu.org) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום תרבות חיובית של 2 נקי מסמים בארות, הסמים המכילים בארות יש לקרוא. כל צמיחה בנוכחות התרופה מציין עמידות לתרופה זו. הערה: אם הקריאה של סמים המכילים בארות נעשה&gt; 1 שבוע אחרי תרבות חיובית הוא ציין את התרופה ללא בארות, זה לא יכול לייצג את ההתנגדות כמו פריצת דרך צמיחה נתפסת לעתים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות שאינן חיוביות על ידי 21 יום נחשבים תרבויות שלילי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכירות הבארות היא תוצאה של זיהום יתר, בעוד הצמיחה mycobacterial אינו תוצאה של עננות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סיום 21 ימי התרבויות עשוי להיות מושלך. תרבויות להישאר שקיות אטום שלהם ממוקמות בתוך שקיות החיטוי ו autoclaved על 121-124 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דקות </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Arias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+microscopic-observation+drug-susceptibility+assay+for+detection+of+tuberculosis.">Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis.</a> Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).</li><li>Caviedes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+detection+and+drug+susceptibility+testing+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+sputum+by+microscopic+observation+of+broth+cultures.+The+Tuberculosis+Working+Group+in+Peru.">Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru.</a> J Clin Microbiol. 38, 1203-1203 (2000).</li><li>Caviedes, L., Moore, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+MODS:+a+low-cost,+low-tech+tool+for+high-performance+detection+of+tuberculosis+and+multidrug+resistant+tuberculosis.">Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis.</a> Indian J Med Microbiol. 25, 87-87 (2007).</li><li>Caws, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MODS+culture+technique+for+the+diagnosis+of+tuberculous+meningitis.">Evaluation of the MODS culture technique for the diagnosis of tuberculous meningitis.</a> PLoS ONE. 2, e1173-e1173 (2007).</li><li>Ejigu, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic-observation+drug+susceptibility+assay+provides+rapid+and+reliable+identification+of+MDR-TB.">Microscopic-observation drug susceptibility assay provides rapid and reliable identification of MDR-TB.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 12, 332-332 (2008).</li><li>Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+occupational+tuberculosis+in+National+Tuberculosis+Programme+laboratories+in+Korea.">Risk of occupational tuberculosis in National Tuberculosis Programme laboratories in Korea.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 11, 138-138 (2007).</li><li>Mello, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+microscopic+observation+drug+susceptibility+assay+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+resistance+to+isoniazid+or+rifampin.">Clinical evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid or rifampin.</a> J Clin Microbiol. 45, 3387-3387 (2007).</li><li>Moore, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+prospects+for+the+MODS+assay+in+multidrug-resistant+tuberculosis+diagnosis.">Future prospects for the MODS assay in multidrug-resistant tuberculosis diagnosis.</a> Future Microbiol. 2, 97-97 (2007).</li><li>Moore, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrequent+MODS+TB+culture+cross-contamination+in+a+high-burden+resource-poor+setting.">Infrequent MODS TB culture cross-contamination in a high-burden resource-poor setting.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 56, 35-35 (2006).</li><li>Moore, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic-observation+drug-susceptibility+assay+for+the+diagnosis+of+TB.">Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB.</a> N Engl J Med. 355, 1539-1539 (2006).</li><li>Moore, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observation+drug+susceptibility+assay,+a+rapid,+reliable+diagnostic+test+for+multidrug-resistant+tuberculosis+suitable+for+use+in+resource-poor+settings.">Microscopic observation drug susceptibility assay, a rapid, reliable diagnostic test for multidrug-resistant tuberculosis suitable for use in resource-poor settings.</a> J Clin Microbiol. 42, 4432-4432 (2004).</li><li>Moore, D. A., Roper, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+smear-negative+tuberculosis+in+people+with+HIV/AIDS.">Diagnosis of smear-negative tuberculosis in people with HIV/AIDS.</a> Lancet. 370, 1033-1033 (2007).</li><li>Oberhelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+recovery+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+children+using+the+microscopic+observation+drug+susceptibility+method.">Improved recovery of Mycobacterium tuberculosis from children using the microscopic observation drug susceptibility method.</a> Pediatrics. 118, e100-e100 (2006).</li><li>Palomino, J. C., Martin, A., Portaels, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODS+assay+for+the+diagnosis+of+TB.">MODS assay for the diagnosis of TB.</a> N Engl J Med. 356, 188-189 (2007).</li><li>Park, W. G., Bishai, W. R., Chaisson, R. E., Dorman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+microscopic+observation+drug+susceptibility+assay+in+drug+susceptibility+testing+for+Mycobacterium+tuberculosis.">Performance of the microscopic observation drug susceptibility assay in drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 4750-4750 (2002).</li><li>Shiferaw, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microscopic+observation+drug+susceptibility+assay+for+detection+of+multidrug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of microscopic observation drug susceptibility assay for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 45, 1093-1093 (2007).</li><li>Tovar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnosis+of+pleural+tuberculosis+using+the+microscopic-+observation+drug-susceptibility+technique.">Improved diagnosis of pleural tuberculosis using the microscopic- observation drug-susceptibility technique.</a> Clin Infect Dis. 46, 909-909 (2008).</li><li>Vargas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sputum-scarce+HIV-associated+pulmonary+tuberculosis+in+Lima,+Peru.">Diagnosis of sputum-scarce HIV-associated pulmonary tuberculosis in Lima, Peru.</a> Lancet. 365, 150-150 (2005).</li></ol>

Assay MODS מיועד משאב מוגבל הגדרות. בפעם הראשונה, MODS מביא את היכולת לאיתור מהיר תרבות נוזלי של שחפת multidrug שחפת עמידים משאב מוגבל רק על הגדרות תחת 3 דולר הבדיקה. MODS הוא שאינה קניינית, איטרטיבי מתודולוגיה, והקהילה MODS מעוניינת תמיד שיפורים מעבדות אחרות הצליחו לעשות. <p style=";text-align:right;directio...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Refrigerator/ freezer</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to store pre-prepared broth and antibiotic stocks</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to aid sputum decontamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; does not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed)</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubator (37 degree C)</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for culture; need not be CO2 enriched</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted light microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to read MODS plates</td>
</tr>
<tr>
<td>Autoclave</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to sterilize media, PBS and used plates</td>
</tr>
<tr>
<td>Balance</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to weigh isoniazid, rifampicin and NALC</td>
</tr>
<tr>
<td>Middlebrook 7H9 broth (Difco)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>DF0713-17-9</td>
<td>500gr/bottle; culture media base</td>
</tr>
<tr>
<td>Casitone (pancreatic digest casein)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>DF0259&#x2010;17&#x2010;9</td>
<td>500gr/bottle; culture media base</td>
</tr>
<tr>
<td>Glycerol (glycerin) lyophilized</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G&#x2010;33&#x2010;500</td>
<td>500ml/bottle; culture media base</td>
</tr>
<tr>
<td>PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>B4345114</td>
<td>6 bottles/pack; antibiotic media supplement</td>
</tr>
<tr>
<td>OADC (Middlebrook OADC enrichment BD)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>B11886</td>
<td>10 x 20ml/pack; nutritional media supplement</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-2650</td>
<td>100ml/bottle; to prepare rifampicin stock</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic stocks: isoniazid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-3377</td>
<td>50gr/bottle; direct susceptibility testing</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic stocks: rifampicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma 99</td>
<td>R-3501</td>
<td>1gr/bottle; direct susceptibility testing</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (pellets)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>221465</td>
<td>500gr/bottle; sputum decontamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate (trisodium salt dihydrate)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-4641</td>
<td>500gr/bottle; sputum decontamination</td>
</tr>
<tr>
<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-7250</td>
<td>50gr/bottle; sputum decontamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P0662</td>
<td>500gr/bottle; sputum decontamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>500gr/bottle; sputum decontamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypochlorite</td>
<td>Reagent</td>
<td>household bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to discard contaminated waste</td>
</tr>
<tr>
<td>15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35&#x2010;2096)</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>14&#x2010;959&#x2010;49B</td>
<td>500ea/case; for sputum decontamination and concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35&#x2010;3047)</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1</td>
<td>50 plates/case; for culture and reading</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealable polythene bags 6 X 6 &#x201C; (ziplock)</td>
<td>Consumable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for biosecurity to contain 24 well plate</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm)</td>
<td>Consumable</td>
<td>VWR</td>
<td>47729-583</td>
<td>500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth</td>
</tr>
<tr>
<td>Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml)</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>05&#x2010;669&#x2010;22</td>
<td>1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks</td>
</tr>
<tr>
<td>0.22&#x03BC;m filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>SLGL 025 OS</td>
<td>50 units/case; to filter antibiotic stocks</td>
</tr>
<tr>
<td>0.22&#x03BC;m filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>SLGV 033 RS</td>
<td>50 units/case; to filter antibiotic stocks</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9&#x2033;</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>13&#x2010;678&#x2010;20C</td>
<td>720ea/case; to mix PANTA with media mix</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosol barrier tips 1000&#x2010;1300&#x03BC;l</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>02&#x2010;707&#x2010;51</td>
<td>1000ea/pk; to dispense media into plate</td>
</tr>
<tr>
<td>USA Scientific Tips One 1&#x2010;200&#x03BC;l yellow tips</td>
<td>Consumable</td>
<td>Fisher</td>
<td>1111&#x2010;0006</td>
<td>1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

the mods method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

חולים עם שחפת ריאתית פעילה (TB) 10-15 להדביק אנשים אחרים בשנה, מה שהופך לאבחון שחפת פעילה חיוני הן לרפא את המטופל ומניעת זיהומים חדשים. יתר על כן, את הופעתה של multidrug שחפת עמידים (MDRTB) כלומר זיהוי של עמידות לתרופה הכרחי לעצור התפשטות של זנים עמידים לתרופה. תצפית מיקרוסקופית, רגישות לתרופות (MODS) assay היא בעלות נמוכה, low-tech כלי לגילוי בעל ביצועים גבוהים של שחפת MDRTB. Assay MODS מבוססת על שלושה עקרונות: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) גדל מהר יותר בתקשורת נוזל מאשר על התקשורת מוצק 2) צמיחה MTB מיקרוסקופי ניתן לאתר מוקדם יותר בכלי התקשורת נוזל מאשר לחכות להופעת מקרוסקופית של מושבות על התקשורת מוצק, כי הצמיחה האופיינית MTB, שמאפשר לו להבחין בין זיהום mycobacteria או פטרייתי או חיידקי טיפוסיות 3) התרופות isoniazid ו ריפמפיצין ניתן לשלב assay MODS כדי לאפשר זיהוי ישיר סימולטני של MDRTB, obviating את הצורך תת לבצע תרופה עקיף רגישות הבדיקה. אבחון הנוכחית מתחרים הם הקשו על ידי רגישות נמוכה למרוח עם כיח, עיכובים ארוכים עד לאבחון עם תרבות התקשורת מוצק, עלות גבוהה להחריד עם נוזל התקשורת השיטות הקיימות התרבות, צריך לעשות תת לבדיקת רגישות עקיף התרופה כדי לזהות MDRTB. לעומת זאת, שיטה שאינה קניינית MODS בעל רגישות גבוהה עבור שחפת MDRTB, היא שיטה התרבות מהירה יחסית, מספק בדיקות סימולטני הרגישות תרופה MDRTB, והוא נגיש מוגבל משאב הגדרות בבית רק תחת $ 3 עבור בדיקת שחפת MDRTB.

Watch this Scientific Journal Video about The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis at JoVE.com

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

תצפית מיקרוסקופית, רגישות לתרופות (MODS) assay היא בעלות נמוכה, low-tech כלי לגילוי בעל ביצועים גבוהים של שחפת (TB) ו multidrug עמיד שחפת (MDRTB). וידאו זה מתאר את שיטת התקשורת MODS נוזלי תרבות.

השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

the-mods-method-for-diagnosis-tuberculosis-multidrug-resistant

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Views.  The Warren Alpert Medical School of Brown University. תצפית מיקרוסקופית, רגישות לתרופות (MODS) assay היא בעלות נמוכה, low-tech כלי לגילוי בעל ביצועים גבוהים של שחפת (TB) ו multidrug עמיד שחפת (MDRTB). וידאו זה מתאר את שיטת התקשורת MODS נוזלי תרבות.

Video: The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...