עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע הגרמנית (DFG) ויוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית.

1. Crosslinking של חומר צמחי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר 1-2G עלים ארבידופסיס (6 לקוטר שושנת 10 ס&quot;מ) בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל פלסטיק למלא עד 40mL עם חיץ crosslinking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא עלים להישאר שקוע, למשל על ידי מלית זכות המותאמים ספוג לסנן מעל פני השטח חיץ. אז במקום צינורות ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור עבור 10min. כדי להוסיף צינור כל 2.5mL של גליצין 2M להפסיק crosslinking, וכן להפוך צינורות כדי להצדיק פיזור שווה של גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור עבור 5min נוסף וזורקים נוזל תוך קצירת העלים על מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם העלים 1 ליטר של מים בכוס זכוכית, אז העלים היבשים ביסודיות בעזרת מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף העלים בצינור פלסטיק טריים להקפיא בחנקן נוזלי. חנות יוצאת בשעה -80 ° C עד הבידוד הכרומטין. </li></ol> 2. בידוד של הכרומטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלים היו הקרקע עם מרגמה פיסטיל כי הוחזקו חנקן נוזלי עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת אבקת שפופרת 50 מ&quot;ל פלסטיק להשעות במאגר מיצוי 30 מ&quot;ל # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 15min ב 4 ° C על שייקר תקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין ההשעיה דרך ארבע שכבות של miracloth לתוך צינור 50 מ&quot;ל טרי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין עבור 20min XG ב 2800 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו להשעות גלולה עם מברשת צבע במאגר מיצוי 1mL # 2. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 2, אז להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את שאר חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה לצינור microfuge ספין 1.5mL עבור 10min ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין 2ml-microfuge צינורות המכיל מאגר מיצוי 1.5mL # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מהצינור סובב (שלב 2.7) ו להשעות גלולה ב 300μL של חיץ מיצוי # 3. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 3, להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את המאגר הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות pipet מושעה גלולה (שלב 2.9) על גבי החיץ 1.5 מ&quot;ל מיצוי # 3 מוכן בשלב 2.8. ודא כי שני השלבים לא לערבב. ספין עבור 1h ב XG 16,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו להשעות הכרומטין גלולה עם מברשת צבע 300μL של חיץ sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הכרומטין עם sonotrode, או באמבטיה קולי, לגודל ה-DNA של 400bp כ. כאשר sonicating, לעשות הכרומטין בטוח לא יהיה מחומם מעל כ -30 ° C כדי להגן רגישים לחום crosslinks. משך sonication צריך להיקבע באופן ניסיוני, כי זה משתנה באופן משמעותי בין התקנים sonication שונים. לקבלת הדרכה, ההגדרות עבור שני מכשירים שונים ניתנים: </li></ol> עבור sonication עם sonotrode המותג Bandelin לחשוף הכרומטין בצינור microfuge 0.6mL חמש פעמים עד 20 התפרצויות עם הגדרות 25%, מחזור כוח = 50. תוך כדי כך, מדגם מגניב אחרי כל 20 התפרצויות ה באמבט קרח. עבור sonication עם אמבטיה Diagenode Bioruptor קולי, למלא אמבטיה עם מים וקרח sonicate עשר פעמים במשך 30 שניות בתוך צינורות microfuge 1.5mL עם ההגדרה &quot;גבוה&quot;. אחרי כל 30 שניות, דגימות מגניב עוד 30 שניות. <ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין sonicated מדגם עבור 5min ב g 16,000 ב 4 ° C כדי לזרז חומר שלא נמס. Supernatant יכול ישירות לשמש immunoprecipitation. לחלופין, ניתן דגימות הלם קפוא בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2-mL צינורות microfuge המכיל חלבון 40μL agarose ו 1.8mL של חיץ נוגדן מחייב. הוסף 200μL של הכנת הכרומטין (שלב 2.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות עבור 1h על שייקר תקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל חלבון חרוזים agarose ולהשתמש supernatant עבור immunoprecipitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 40μL-aliquot כדי לקבוע ריכוז הכרומטין (&quot;קלט&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30μL חלבון agarose ואת כמות הנוגדנים שינוי ספציפי זה המצוין בטבלה שלהלן של ריאגנטים ספציפיים וציוד ההשעיה 400μL הכרומטין sonicated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 2.5h או לילה על שייקר תקורה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים עבור 2min ב 440 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוז גלולה 900μL של חיץ כל לשטוף (ראה רשימה להלן). במשך כל חיץ, חרוזים דגירה במאגר עבור 10min על שייקר ממעל על 4 מעלות צלזיוס, אז בשביל ספין 2min ב XG 440, להשליך supernatant, ולהוסיף את המאגר הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח נמוכה לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח גבוהה לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LiCl לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE לשטוף חיץ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, להסיר לחלוטין כל חיץ הנותרים. </li></ol> 4. De-crosslinking של היסטונים ו-DNA, וטיהור של ה-DNA זירז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μL של חיץ דה crosslinking של גלולה agarose מדגם &quot;קלט&quot; את 40μl משלב 3.4, תערובת של 5min על מערבל מערבולת, דגימות ספין, incuבייט ב 65 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA עם DNA מסחרי או ערכת טיהור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל 5μl של דילול של 1:05 eluate הטור הסופי מספיקים כדי לבצע קונבנציונאלי מוקד ספציפי בזמן אמת כמותי RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol> 5. טבלה של מאגרים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Crosslinking חיץ </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> 3% (V / V) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> הפקת המאגר # 1 </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> הפקת המאגר # 2 </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> הפקת המאגר # 3 </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 0.15% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Sonication חיץ </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 25mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> נוגדן מחייב חיץ </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 50mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מלח נמוכה לשטוף חיץ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מלח גבוהה לשטוף חיץ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> LiCl לשטוף חיץ </td></tr><tr><td> ליתיום כלוריד </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> 1% (V / V) </td></tr><tr><td> נתרן desoxycholate </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> TE לשטוף חיץ </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Decrosslinking חיץ </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 6.8 </td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mm </td></tr></tbody></table> 6. נציג התוצאות: הביטוי של הגן ארבידופסיס thaliana PR2 הגנה קידוד β-1,3-glucanase עם פעילות מיקרוביאלית 12, הנגרמת על ידי benzothiadiazole (BTH), אנלוגי סינתטי של חומצה סליצילית הורמון צמח 3. איור 1 מראה כי הפעלת הביטוי PR2 קשורה לעלייה acetylation של שאריות ליזין על היסטון H3 ו-H4 על האמרגן PR2. מאז צפיפות הנוקלאוזום פוחתת במהלך הפעלת הגנים 13, ערכים acetylation היסטון היו מנורמל עבור האות המתקבל עם נוגדן לאזור משתנה של היסטון 3. <img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1 BTH גורם acetylation היסטון על האמרגן PR2 ב ארבידופסיס. צמחים שטופלו 100μM BTH או פקד אבקת wettable. לאחר 72h, העלים נאספו הכרומטין היה מבודד. האות המתקבל לאחר משקעים עם נוגדנים ספציפיים acetylation (כמצוין באיור) היה מנורמל לאות מתקבל על ידי משקעים עם נוגדן ל תחום משתנה של היסטון H3. הכרומטין זירז היה לכמת על ידי RT-qPCR. הנתונים סטנדרטי עבור רמות שינוי היסטון בהעדר טיפול BTH.

<ol>
	<li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin.">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> EMBO rep. 3, 224-229 (2002).</li><li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3:+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic.">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> 25, 15-30 (2007).</li><li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response.">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> EMBO rep. 12, 50-55 (2011).</li><li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter.">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> Plant Cell. 18, 119-132 (2006).</li><li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize.">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).</li><li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis.">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).</li><li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+GCN5,+HD1,+and+TAF1/HAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression.">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).</li><li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+techniques+for+plant+cells.">Chromatin techniques for plant cells.</a> Plant Journal. 39, 776-789 (2004).</li><li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation.">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Meth. 3, 11-11 (2007).</li><li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize.">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> Plant J. 53, 465-474 (2008).</li><li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+in+Arabidopsis.">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 4, 645-656 (1992).</li><li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+displacement+in+transcription.">Nucleosome displacement in transcription.</a> Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם crosslinking של דנ&quot;א ההיסטונים, סוג וכמות החומר עלה, שחיקה של החומר, ואת sonication של הכרומטין. לדיון מפורט יותר של סוגיות אלה, ראה השופטים. 9 ו -10. Sonication ו crosslinking: חשוב לשבש הכרומטין במהלך sonication כדי שברי על 400bp. Sonication ממצה יהרוס הכרומטין ע&quot;י שיבוש דנ&quot;א ההיסטונים, ואילו sonication מספיק יותיר שברים הכרומטין ארוך. אלו משפיעים על סגוליות של השיטה, כי שינויים היסטון דיסטלי של מוקד שנבדקו לא ניתן להפלות בין שינויים מקומיים. יעילות Sonication נבדק הטובה ביותר על ידי איסוף דגימות הכרומטין 20μL לפני ואחרי ה-DNA, דה crosslinking sonication ו ההיסטונים, בידוד דנ&quot;א בקביעת אורכו של ה-DNA טעון על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. RNAse יש להוסיף את דגימות לפני אלקטרופורזה, משום הכנה הכרומטין עדיין מכיל כמויות גדולות של RNA בשלב הזה של טיהור שעשוי להפריע להדמיה של ה-DNA מקוטעת. הדגימות שימושיים immunoprecipitation הכרומטין אם דנ&quot;א הכרומטין אי טעון ארוך יותר 10kbp, בעוד ה-DNA של הכרומטין טעון צורות כתם עם עוצמת אות מקסימלית סביב 400bp של ה-DNA. אנו משתמשים באופן שגרתי 3% (v / v) פורמלדהיד עבור crosslinking הכרומטין בעלים שלמים, אבל 1% (v / v) פורמלדהיד עשוי להיות מספיק ברוב המקרים. בידיים שלנו, פורמלדהיד בריכוזים נמוכים מאפשרים פעמים sonication קצר אותות רקע עקב התגובות PCR. עם זאת, כמויות מספיקות של פורמלדהיד לעיתים לגרום reproducibility נמוך של האות PCR בין ניסויים עצמאיים. זה יכול להיות בגלל חדירה מספקת של עלים עם פורמלדהיד בריכוזים נמוכים. הקפד בורסה פורמלדהיד שלך בתדירות גבוהה ככל במתחם נוטה לפלמר עם הזמן. פורמלדהיד פתרונות יציבים רק למשך חודש אחד בערך, וגם זה בקושי תקופה ממושכת על ידי ייצוב מתנול. מומלץ לבדוק את ריכוזי פורמלדהיד שונים בעת הגדרת תנאי הניסוי. כמות של חומר צמחי וטחינה: חשוב לחדור כמויות נמוכות של החומר עלה בנפח גדול של חיץ כדי למנוע עלים דבוקים זה לזה. ליף דבק לעתים קרובות תוצאות חדירה מספקת של פורמלדהיד. יתר על כן, חומר צמחי רב מדי יחסום נקבוביות של הרקמה miracloth. יעילות שחיקה ניכרת תלוי בעזרת מכתש ועלי עם התאמה מושלמת. אנו שגרתי לטחון עם העלי חנקן נוזלי מקורר ו מרגמה בהעדר חנקן נוזלי נוספות שלוש פעמים במשך 50 שניות עד החומר הקרקע לאבקה דקה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> חלבון-A-agarose </td><td> רוש </td><td> 11 134 515 001 </td><td> תלוי בכיתה נוגדן </td></tr><tr><td> חלבון ה-G-agarose </td><td> רוש </td><td> 11 243 233 001 </td><td> תלוי בכיתה נוגדן </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> השתמשנו 1μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> השתמשנו 1μL </td></tr><tr><td> Anti-trimethyl-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-דימתיל-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-monomethyl-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> השתמשנו 1μL כדי לבדוק צפיפות היסטון </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD TO-200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> רוש </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of histone modifications in plant leaves

מבנה הכרומטין חשוב בוויסות של ביטוי גנים אאוקריוטים. בתהליך זה, שיפוץ הכרומטין, מתילציה DNA, שינויים קוולנטיים על אמינו מסוף הזנבות של ההיסטונים H3 ו-H4 ממלאים תפקידים חיוניים 1-2. H3 ו-H4 שינויים היסטון כוללים מתילציה של ליזין ארגינין, acetylation של ליזין, ו זרחון של שיירי סרין 1-2. שינויים אלו קשורים גם עם הפעלת הגן, דיכוי, או מדינה ערוכה של הגן התומכת הפעלה מהירה יותר וחזקה הביטוי אחרי תפיסה של אותות המתאים (חיידק הקשורים דפוסי מולקולרית, אור, הורמונים וכו &#39;), 3-7. כאן, אנו מציגים שיטה לגילוי אמין ורגיש של שינויים הכרומטין גנים ספציפיים על הצמח הנבחר. הטכניקה מבוססת על crosslinking של (שינה) היסטונים ו-DNA עם 8,9 פורמלדהיד, מיצוי sonication של הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) עם נוגדנים ספציפיים שינוי 9,10, דה crosslinking-DNA של היסטון קומפלקסים, ו גנים ספציפיים בזמן אמת PCR כמותי. הגישה הוכיחה שימושי לאיתור שינויים היסטון ספציפיות הקשורות הפוטוסינתזה C 4 ב 5,11 תירס חסינות מערכתי 3 ארבידופסיס.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Histone Modifications in Plant Leaves at JoVE.com

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Views.  RWTH Aachen University. גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.

Video: Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid tissues due to unnaturally rapid cell replication. This is particularly challenging when modeling mature chromatin, as fast replicating cells are frequently involved in DNA replication and have a heterogeneous polyploid population. Presented below is a workflow for modeling, treating, and analyzing quiescent chromatin modifications using a three-dimensional (3D) cell culture system. Using this protocol, hepatocellular carcinoma cell lines are grown as reproducible 3D spheroids in an incubator providing active nutrient diffusion and low shearing forces. Treatment with sodium butyrate and sodium succinate induced an increase in histone acetylation and succinylation, respectively. Increases in levels of histone acetylation and succinylation are associated with a more open chromatin state. Spheroids are then collected for isolation of cell nuclei, from which histone proteins are extracted for the analysis of their post-translational modifications. Histone analysis is performed via liquid chromatography coupled online with tandem mass spectrometry, followed by an in-house computational pipeline. Finally, examples of data representation to investigate the frequency and occurrence of combinatorial histone marks are shown.

This protocol outlines how a three-dimensional cell culture system can be used to model, treat, and analyze chromatin modifications in a near-physiological state.

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...