עבודה זו נתמכת על ידי קרן עירונית מ NIAID, NIH.

1. הכנת התאים המוסמכת chemotactic של discoideum Dictyostelium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר תאים ד discoideum כי הם chemotactic למחנה chemoattractant, תאים הקציר הגוברת D3-T מדיה עשירה מתרבות רועד ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים חיץ שאינו מזין התפתחותי (חיץ DB המכיל 5 mM Na 2 HPO 4, 5 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 0.1 מ&quot;מ CaCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תאים חיץ DB בצפיפות של 2x10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake 10 תאים מ&quot;ל בבקבוק 250 מ&quot;ל ב 100 סל&quot;ד ב 22 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספק 100 μl של המניה 7.5 מיקרומטר cAMP ל 10 תאים מ&quot;ל כל שש דקות מעל 6 שעות כדי להשיג הריכוז הסופי של מחנה 75 ננומטר, תהליך המיועד לטיפול cAMP פועם. לאחר 5-6 שעות של טיפול cAMP פועם, ד תאים discoideum להיות chemotactic המוסמכת שיפוע לכיוון המחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות ואז התאים resuspend עם חיץ DB המכיל קפאין 2.5 מ&quot;מ, וללחוץ על 200 סל&quot;ד ב 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי basolate התא למצב chemotactic. </li></ol> 2. הדמיה chemotaxing תאים צבע chemoattractant גלוי למניפולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למילוי micropipette עם פתרון מוכן טרי 30 μl של מחנה 1 מיקרומטר ו אלקסה 594 ב 0.1μg/μl במאגר DB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את Femtotip לבעל micropipette ולחבר את צינורות אל מנגנון אספקת הלחץ, מערכת Eppendorf FemtoJet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הרכבה micropipette כדי micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) ממונע micromanipulator לתת לחץ קבוע על מנת ליצור שיפוע יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תא אחד טוב LabTek מלא 6 מ&quot;ל של חיץ DB על העדשה שמן 40X על מיקרוסקופ confocal ולהשתמש בהיר בתחום האופטיקה, במרכז Femtotip לשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אספקת הלחץ ולהגדיר את הלחץ פיצוי (PC) עבור 70 hPa להקים שיפוע של התערובת 594 cAMP / Alexa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו מפל cAMP על ידי ניטור תערובת של הריכוז הרצוי של המחנה אלקסה 594 הקרינה באמצעות עירור עם קו 543 ננומטר לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש אוטומטי מיצוב תפקידו של micromanipulator לשים micropipette לעמדות הרצוי ולהגדיר אותם 1 מיקום, מיקום 2, ומיקום 3 לתפעל את שיפוע אשר תא חשופים. </li></ol> 3. תא נייח מערכת nonpolarized מקלה אירועים הדמיה איתות מעורבים במחנה שיפוע חישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול בקפאין, להסיר aliquot של תאים צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ ו לדלל התאים 5x10 5 תאים / מ&quot;ל עם חיץ DB טרי המכיל קפאין 2.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 מ&quot;ל של השעיה תא לתא בודד טוב או 0.4 מ&quot;ל היטב בכל תא ארבעה באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לדבוק תאים עבור 10 דקות, בזהירות פיפטה את החיץ להסיר תאים פנויים ולהחליף עם נפח זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את התאים תחת מיקרוסקופ הרצוי ולהתחיל הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי שנועד לפקח על הדינמיקה של איתות רכיבים בתאים לחשוף את שיפוע יציב, לטיפול בתאים עם 5.0 מיקרומטר (הריכוז הסופי) Latrunculin ב 10 דקות לפני הניסויים. </li></ol> 4. ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP 3 הייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cAMP פועם לפתח תאים שיתוף להביע GαCFP ו YFPGβ (תאים G) ותאי להביע PIP 3 אינדיקטור PH-GFP (תאים PH) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני סוגי תאים עם יחס 1:1 ו צלחת אותם לתאי אחד טוב או 4-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ושמור את טביעת האצבע פליטת התייחסות עקומת CFP, YFP ו-GFP באמצעות רכישת Lambda מצב סטאק בטווח הספקטרום מ 464 ל 624 ננומטר עם רוחב של 10 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל תמונה חלבון G הפעלה בתאים G ו-3-PIP ייצור תאים עם PH באמצעות רכישת אותו במצב Lambda סטאק בטווח הספקטרום 464-544 ננומטר עם 10 ננומטר במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לתפקד unmixing שכבות של תוכנת 510META Zeiss באמצעות הציל CFPand YFP ואת טביעות אצבעות פליטת מתמטית כדי לחשב את התרומה של כל fluorophore בערימה Lambda להפריד את CFP ועוצמת YFP לאפיקים בודדים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אסטרטגיה דומה, להחיל unmixing פונקציה לינארית באמצעות GFP ניצלו פליטה טביעות אצבעות רקע מתמטי לחישוב עוצמת ה-GFP בתאים PH. </li></ol> 5. נציג התוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. אמבה חברתיים, ד discoideum תערוכות chemotaxis בולט במהלך מחזור החיים. בשל יתרונות גנטיים ביוכימיים שלה, ד ד מספק של עוצמהystem ללמוד chemotaxis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. הנה, אנחנו הראשונים להראות מתודולוגיה פשוטה כדי להשיג קשר לינארי בין מחנה הריכוז לבין עוצמת צבע פלואורסצנטי אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל Alexa 594 (איור 2 א). הבא, אנחנו מספקים דרך קלה כדי להמחיש את שיפוע יתר על כן, להקים מדידה כמותית למחנה הריכוז של צבע מעוצמת Alexa 594 (איור איור. 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. מעכב פילמור אקטין מבטלת קיימים הקוטביות מורפולוגיים גם מונע תנועת התא תוך שמירה על יכולת של התאים של חישה כיוונית (איור 3A). התעסוקה של גירוי cAMP גלוי למניפולציה ערבויות קלט, למשל גירויים אחיד או שיפוע. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של חלוקה מחדש cAMP-Induced של רכיבים איתות מפתח במנגנון שיפוע חישה. הדינמיקה spatiotemporal מדודים של רכיבים אלה איתות מאפשרים לנו להבין כיצד רשת איתות משיגה הסתגלות גירויים אחיד תוך יצירת תגובות ביוכימיות מקוטב אל הדרגתיים (איור 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. זה קריטי על מנת למדוד את הדינמיקה / קינטיקה של כיוונית חישה איתות רכיבים להבין איך כל מרכיב תורם להקמת קיטוב תאיים, כאשר התאים חווים שיפוע הראשון. יישום של הדמיה תא חי עם החלטה הקצב מרחבית גבוהה, אנחנו הראשונים מראים ייצור biphasic PIP3 של התא שבו הוא נחשף מפל cAMP יציב (איור 4A-C). יישום הדמיה תא חי, יש לנו למדוד באופן שיטתי את הדינמיקה של כיוונית חישה רשת איתות ספציפיים גירוי cAMP לייצור PIP3 (איור 4D, E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP 3 הייצור על גירוי cAMP אחיד. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (מקוצר סריג) מספק גישה יעילה לעקוב heterotrimeric הפעלת חלבון G (דיסוציאציה) על גירוי המחנה. כאן, אנו תיאר מערכת נוח וקל לאמץ מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric 3 הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP 3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה (איור 5 ). גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G בעוד מתמשך אשר מעורר ייצור חולף 3 PIP. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1: מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. א Scheme מציגה מסלול איתות קצר של חישה כיוונית. שיפוע ב cAMP גורם chemotaxis המהירה של ד discoideum תאים. תאים להביע 3 PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. בר סולם = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2: Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. גרף א &#39;מציג מערכת יחסים בין ליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל אלקסה 594. מדידה כמותית ב למחנה הריכוז של צבע על ידי הקשר הליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 א &#39; <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3: תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. תמונה א &#39;מראה כי התאים ללא תנועה על ידי טיפול של פילמור אקטין מעכב Latrunculin B לשמור על יכולת חישה של כיווניות. תאים להביע 3 PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. B. למניפולציה גירויים תנועה cAMP מערכת התא מאפשר לענות על שאלות המפתח של חישה כיוונית. בר סולם = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4: מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. א מונטאז&#39; מראה PIP biphasic 3 הייצור (ירוק) של התא, אשר נחשף מפל cAMP יציב (אדום). B. תמונה המציגה את האזורים של אינטרסים (ROIs) למדידת קינטיקה של ייצור PIP 3 הציג ב C. C . קינטיקס oו 3 ​​PIP ייצור התאים נחשפים שיפוע קבוע. ד Scheme מראה את רשת איתות של חישה כיוונית מן גירוי cAMP לייצור PIP 3. קינטיקה שלהם בחשיפה שיפוע קבוע מוצג הקווים באותו צבע מוצק E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5: ניטור סימולטני רב אירועים של רשתות איתות GPCR. תוכנית א &#39;מראה מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric 3 הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה. מונטאז&#39; של תמונות ב קשת של G ו-PH מראה תאים כי גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G מתמשך על התא הפריפריה, בעוד אשר מעורר ייצור חולף PIP3. נקודות הזמן הן לפני (0s) ואחרי גירוי עבור 4.9s, 10.2s ו 20.4s. ג קינטיקה של הפעלת חלבון G ו PIP3 הייצור על גירוי מחנה אחיד.

<ol>
	<li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis.">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li><li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors.">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li><li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium.">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li><li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method.">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li><li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing.">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li><li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis.">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li><li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells.">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li><li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phosphatidylinositol+3'+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium.">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction.">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li><li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt/PKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium.">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 .</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells.">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis.">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients.">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li><li>Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תהליכי להגיע לשלב המוסמכת chemotactic של תאים עבור סוג ד בר תאים discoideum, זה לוקח בערך 5 ~ 6 שעות פועם פיתוח בטמפרטורת החדר כדי לגרום להם לשלב היטב chemotactic מוסמך שבמהלכו התאים להציג מורפולוגיה הסלולר מקוטב היטב נדידת תאים מהיר (איור ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> D3-T צמיחה מדיה </td><td> KD רפואי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קפאין </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלכסה 594 </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT לתכנות טיימר </td><td> ChronTrol קורפ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 peristaltic משאבה </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמה רוטרי שייקר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet אספקת הלחץ microcapillary </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סינגל וארבע היטב Lab-Tek II coverglass לתאי </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META או מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקבילה </td><td> Zeiss </td><td></td><td> 40X 1.3 NA או 60x 1.4 NA-DIC שמן תוכנית Neofluar אובייקטיבי עדשה </td></tr><tr><td> אולימפוס X81 או שווה ערך </td><td> אולימפוס </td><td></td><td> דרוש 100x 1.47 NA העדשה TIRF אובייקטיבי </td></tr></tbody></table>

imaging g-protein coupled receptor (gpcr)-mediated signaling events that control chemotaxis of dictyostelium discoideum

התאים האיקריוטים רבים ניתן לזהות הדרגתיים של אותות כימיים בסביבה שלהם ולהעביר בהתאם 1. הגירה זו תא מודרך הוא כאמור chemotaxis, שהוא חיוני עבור תאים שונים כדי לבצע את תפקידם כגון סחר של תאים חיסוניים דפוסים של תאים עצביים 2, 3. משפחה גדולה של חלבון ה-G-מצמידים קולטנים (GPCRs) מזהה פפטידים קטנים משתנה, המכונה chemokines, לכוון את נדידת תאים in vivo 4. המטרה הסופית של chemotaxis המחקר היא להבין כיצד החושים מכונות GPCR chemokine הדרגתיים בקרות אירועים איתות המובילים chemotaxis. לשם כך אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לפקח, בזמן אמת, ריכוזי spatiotemporal התנועה, chemoattractants תא שיפוע של chemoattractant, בתיווך GPCR הפעלה של חלבון ה-G-heterotrimeric, ואירועים איתות תאיים המעורבים chemotaxis של התאים האיקריוטים 5-8 . האורגניזם אוקריוטים פשוטה, discoideum Dictyostelium, מציג התנהגויות chemotaxic הדומים לאלה של לויקוציטים, וד &#39; discoideum היא מערכת מודל מפתח לחקר chemotaxis האיקריוטים. כפי חופשית חיים אמבות, ד תאים discoideum לחלק במדיום עשיר. עם רעב, תאים להזין תוכנית התפתחותית שבה הם מצטברים דרך המחנה בתיווך chemotaxis כדי ליצור מבנים multicullular. רכיבים רבים מעורבים chemotaxis למחנה זוהו ד discoideum. הכריכה של המחנה GPCR (cAR1) גורמת ניתוק של heterotrimeric G-חלבונים לתוך Gγ ואת יחידות משנה Gβγ 7, 9, 10. יחידות משנה Gβγ להפעיל ראס, אשר בתורו מפעיל PI3K, המרת PIP 2 לתוך PIP 3 על קרום התא 11-13. PIP 3 לשמש אתרי קישור החלבונים עם הומולוגיה pleckstrin (PH) תחומים, ובכך לגייס אלו חלבונים בקרום 14, 15. ההפעלה של רצפטורים cAR1 שולט גם עמותות הממברנה של PTEN, אשר dephosphorylates PIP PIP 2 ל 3 16, 17. מנגנונים מולקולריים הם באבולוציה ב chemotaxis chemokine GPCR בתיווך של תאים אנושיים כגון נויטרופילים 18. אנו מציגים מהשיטות הבאות לחקר chemotaxis ד discoideum תאים. 1. הכנת התאים המרכיבים chemotactic. 2. Chemotaxis הדמיה של תאים מפל cAMP. 3. ניטור הפעלת GPCR המושרה של heterotrimeric G-חלבון בתאים חיים אחת. 4. הדמיה chemoattractant-PIP מופעלות דינמי 3 תגובות בתאים חיים יחיד בזמן אמת. שיטות שפותחו שלנו הדמיה ניתן ליישם מחקר chemotaxis של לויקוציטים אנושיים.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum at JoVE.com

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

imaging-g-protein-coupled-receptor-gpcr-mediated-signaling-events

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

17.9K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של...

Video: Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...