The authors have no Acknowledgements.

1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ד תאים discoideum במדיום AX ב 23 ° C תחת אור בצלחות בתרבית רקמה. אל תשאיר את התאים בצפיפויות גבוהות מעל 75% confluency. הערה: לקבלת מענה מיטבי לחום מתח, תאים צריך להיות בשלב הצמיחה המעריכית וצריך לא הגיעו בשלב נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני ההדמיה, תאים התפצלו בינוני קרינה נמוך (LFM) 1 x 10 4 תאים / מיליליטר. הערה: שלב זה הוא הכרחי כדי להפחית קרינת רקע הנגרם על ידי מדיום AX. זמן הדגירה יכול להיות מופחת למינימום של 2 שעות. עם זאת, שלפוחית ​​נלקחה במדיום AX עדיין יכולה ליצור כמה אות רקע לאחר 2 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הכנות לקראת מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, תאי קציר מהצלחת רקמות LFM ולהעביר מספר מספיק של תאים לתוך מנות תחתיות זכוכית. הערה: בדרך כלל,1 x 10 5 תאים / המ&quot;ל מספיק; עם זאת, אם הגדרת הניסוי דורשת תקופות הדמיה ארוכות (יותר מ -8 שעות), מספרים סלולריים צריכים להיות מותאמים בקפידה, כמו ד תאי discoideum יעברו לעבוד מעגל ההתפתחות ולהתחיל להזרים המצרפי אם מספרים סלולריים הם גבוהים בעוד מזינים נמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להסתפק 20 דקות. הסרת תאים שאינם התיישבו בזהירות על ידי החלפה הבינונית בשימוש עם מדיום חדש. </li></ol></li></ol> הדמיה 2. הערה: הפרוטוקול יכול לשמש במערכות רחב בתחום כמו גם setups מיקרוסקופיה confocal. שימוש תיבת דגירת בקרת טמפרטורה מכסה את היעדים ואת במת מיקרוסקופ הוא מועיל, עדיין לא חיוני בקרת טמפרטורה. הטמפרטורה של תיבת הדגירה מוגדרת הטמפרטורה הגבוהה ביותר השתמשה בניסוי, למשל, ל -40 מעלות צלזיוס אם עומס חום מתבצע. אחרת, את הטמפרטורה מוגדרת 256; C. שינויי טמפרטורה צריכות להתבצע מראש על מנת לאפשר למערכת להסתגל, כמו שינויי הטמפרטורה במהלך ההדמיה יכולים להשפיע על המוקד. הערה: במהלך הדמיה, הטמפרטורה נשלטת באמצעות תא קירור. טמפרטורת ברירת המחדל עבור הדמית תאים שאינם הדגיש היא 23 מעלות צלזיוס. תנאי עומס חום, הטמפרטורה גדלה בהתאם לרמה הרצויה. אלמנט פייזו בתא הקירור יכול להגיב מהר מאוד אל משמרת הטמפרטורה. עם זאת, ההתמקדות של התמונות תשתנה במקצת (זה יכול לסטות עד 20 מיקרומטר בהתאם במשמרת הטמפרטורה). לפיכך refocusing הידנית נדרשת בתוך הדקות הראשונות של רכישת תמונה, אלא אם מיקרוסקופ המשמש מצויד עם דגש אוטומטי חומרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת רכישה בתנאים שאינם הדגישו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה בתנאים שאינם הדגיש ב 23 ° C, לרכוש מינימום של 6 שדות מבט (FOVs). הערה: מצב ללא מתח יכול להיות visualizאד או על ידי הקלטת זמן לשגות קצר (5-30 דקות) או רכישת סטילס נציג. עבור כל קו תנאי או תא לרכוש מינימום של 6 שדות מבט (FOVs). הערה: במקרה תאים בודדים הם בעלי עניין, למקם את התאים המתאימים באמצע FOV ולהקליט סדרת אריח 3 x 3 עם FOV המכיל את התאים של עניין באמצע ד. תאי discoideum הם ניע ועלולים להעביר מתוך FOV. עם זאת, סדרת האריח 3 x 3 מגדילה את השטח בחן באופן פוטנציאלי על ידי התא של עניין והוא נשאר למעקב לתקופות זמן לשגות של ~ 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת Z- ערימות של 7 מיקרומטר מקסימלית 1-0.25 מיקרומטר צעדים כדי ללכוד את כל נפח התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה בשדה בהיר התייחסות להעריך את המספר הכולל של תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת רכישה עבור עומס חום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הטמפרטורה של חדר הקירור עד 30 מעלות צלזיוס על פי הוראות היצרן. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תצוגת הטמפרטורה הגיעה לערך הרצוי, ולמקד ידני בערוץ השדה הבהיר ולבדוק כל FOVs שנרשם לפני תחילת הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל זמן לשגות עבור 4 שעות של עומס חום עם מרווח זמן של 5-10 דקות בין נקודות זמן. בדוק אם נכונה התמקדות במהלך רכישת שתי נקודות בפעם הראשונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת רכישה במהלך התאוששות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עומס החום, להפחית את הטמפרטורה בחזרה ל -23 מעלות צלזיוס, ולחכות תצוגת טמפרטורה להתאים ולמקד באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא זמן לשגות סרטים ב שלב ההחלמה במשך 8-10 שעות ב 10-20 במרווחים דקות זמן. בדקו אם נכונו התמקדות במהלך הרכישה של הנקודה לראשונה. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 3. הערה: כדי לכמת את מספר תאי מחסה מוקדי cytosolic, להעריך את המספר הכולל של תאים ואת מספר התאים עם מוקדי cytosolic בכל זמןמִסגֶרֶת. בשל הקושי של פילוח תאים מתמונות שדה בהירים, כימות צריכות להתבצע באופן ידני. בחלק הבא, ניתוח נתונים מתואר עבור חבילת עיבוד תמונה חינם ((http://fiji.sc/Fiji). זה דורש את הפלאגין &quot;מונה תא&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת מספר כולל של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ערימת תמונה בשדה הבהירה (XYT) על ידי לחיצה על &quot;קובץ&quot; ו &quot;פתח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוסף &quot;תא מונה&quot; ( &quot;תוספים&quot; - &quot;מונה תא&quot;). טען את ערימת תמונה על ידי לחיצה על &quot;אתחול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הסוג המתאים של מונים על ידי סימון התיבה המתאימה. הערה: שימוש מסוג 1 כמו דלפק עבור מספר כולל של תאים מסוג 2 כמו דלפק עבור תאים עם מוקדי cytosolic. לספור את כל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסמנים על ידי לחיצה על &quot;שמור סמנים&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת מספר התאים עם מוקדי cytosolic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; טען את hyperstack תמונה הקרינה (XZYT) ( &quot;קובץ&quot; - &quot;פתח&quot;) ולעשות הקרנת העוצמה המקסימלית באמצעות &quot;Z-מקרן&quot; (תמונה / ערימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוסף &quot;תא המונה&quot;. טען את ערימת התמונה המתקבלת (XYT) על ידי לחיצה על &quot;אתחול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הסמנים על ידי לחיצה על &quot;מרקרים טען&quot;. זהירות: שמות הקבצים של תמונת התייחסות ערימת הקרינה חייבים להיות זהים. במידת הצורך, לשנות בהתאם לפני אתחול מחסנית התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג הסמן המתאים (ראה 3.1.3) ולספור תאים עם מוקדי cytosolic. הסמנים קיימים יכולים לשמש הדרכה לתפקיד של תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזר את מספר ספירות לכל פרוסה על ידי לחיצה על &quot;תוצאות&quot; ולשמור את הספירה במקום אחרת לחישובים נוספים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+a+model+organism:+progress+with+Dictyostelium.">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li><li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+finds+new+roles+to+model.">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li><li>M&#252;ller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+system+-+substantial+share:+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine.">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li><li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q/N-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation.">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li><li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+in+Dictyostelium:+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem.">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li><li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms.">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li><li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium.">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li><li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+yeast.">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li><li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+response+of+Dictyostelium.">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות של חלבון מסוים של ריבית בתגובה ללחץ חום נגרם. העלאת הטמפרטורה ל -30 מעלות צלזיוס דווחה כדי לעורר תגובה חום מתח בתנאים אלה את הכדאיות של ד discoideum מצטמצם במידה ניכרת. שינויים הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להשוות את ההתנהגות של חלבונים שונים באותם תנאי המתח. לשם כך, תאי מבטאי חלבונים שונים עם התג פלורסנט באותו מועברים לתוך מנות רבות גם, כגון ארבע מנות קאמריות (סעיף 1.3.1). הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על תאי שיתוף לבטא חלבונים עם סמנים שונים, כגון GFP או RFP. זה יכול להיות למשל להשתמש כדי לפקח על התנהגותם של מרכיבים שונים של בקרת איכות חלבון (PQC) המערכת. תאים להביע את סמן צבירה מתויג GFP ורכיבי PCQ RFP-tagged שונים ניתן לצפות באמצעות היטב רביםהשביע הדמיה. הדבר מבטיח אותם תנאי המתח (מהירות העלאת טמפרטורה / ירידה, משכו זמן ירידת טמפרטורת גידול /) ומאפשר מחקרים השוואתיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מערכת PQC על תגובת עומס חום. הפעילות של הרכיבים יכולה להיות מווסתת על ידי שינוי רמות ביטוי באמצעות כלים גנטיים כגון נוק-אאוט או ביטוי יתר או באמצעות מעכבים ספציפיים זמינים מסחרי 6. הפרוטאזום יכול להיות מעוכב על ידי הוספת MG132 (100 מיקרומטר) או lactacystin (10 מיקרומטר) אל מדיום הגידול. המלווה Hsp90 יכול להיות מעוכבים באמצעות geldanamycin (6 מיקרומטר) או radicicol (10 מיקרומטר). המלווה Hsp70 יכול להיות מעוכב עם VER-155,088, למרות שאנחנו לא יכולים לאשר את היעילות של העיכוב במסגרות הניסיוניות שלנו עד כה. מעכבים יש להוסיף יום אחד לפני הדמית התאים וטופחו במשך 14 שעות. Criti<html> צעדי cal בתוך הפרוטוקול השלב הקריטי להערכת הפרעות החומות נגרם הוא המדינה של התאים לפני ניסוי ההדמיה. מחקרים הראו כי תאי שמרים לרכוש עמידות מגוון של לחצים סביבתיים בשלב נייח 13. אנו הבחנו גם היענות מינימלית עומס החום מיושם אם ד תאי discoideum הגיעו שלב נייח לפני ההדמיה. לכן, שמירה על מספר תא קבוע &lt;5 x 10 5 תאים / מיליליטר הוא קריטי. יתר על כן, מספרים סלולריים גבוהים יכולים לגרום מעבר מהמעגל וגטטיבי של ד Discoideum למעגל התפתחותית, ובכך מפעיל מסלולים רעבים, אשר עלול להוביל לתגובה שונה לחום מתח. אם מספרים סלולריים גבוהים מתקבלים שלב ההחלמה לאחר עומס חום, הזרמה ותאי צבירה יכולים להפריע ניתוח נתונים שעליהם בנויי התאים לנוע מחוץ לפוקוס (ראה איור 4). תוכן &quot;&gt; הגבלת הטכניקה ההפסד של המוקד הוא צוואר הבקבוק של הפרוטוקול. במהלך שינויי טמפרטורה, במישור המוקד יכול להעביר באופן דרסטי, המחייב refocusing ידני פרק זמן מיד לאחר לשינוי הטמפרטורה. הקפצתי את הפוקוס לפעמים יכול להיות קיצוני מדי בכדי להתגבר עליהם על ידי פוקוס אוטומטי תוכנה, במיוחד אם הזמן בין נקודות הזמן הוא גבוה. עם זאת, אם מיקרוסקופ המשמש מצויד פוקוס אוטומטי חומרה, צוואר הבקבוק הזה ניתן לעקוף. משמעות של הטכניקה ביחס שיטות קיימות לשם השוואה עם setups קיים כגון השימוש של חדרים ממוזגים, תיבות דגירת בקרת טמפרטורה מכסות את היעדים ואת הבמה מיקרוסקופ או בשלבי בקרת טמפרטורה וצווארוני מטרה, השימוש בתא קירור מספק שליטה מדויקת יותר של הסביבה טֶמפֶּרָטוּרָה. פלטייה האלמנט בתא הקירור יכול לשמור על TEM קבוע והאחידperature ברחבי ההתקנה הניסיונית. ב setups הקלסית, הבדלי טמפרטורה מקומיים עשויים להוביל לתוצאות תצפית שונות. יתר על כן, הוא יכול להגיב במהירות במהירות לשינויים מושרים הטמפרטורה, בעוד setups הקלסית להסתגל לאט מאוד לשינויי טמפרטורה מושרות, במיוחד הורדת הטמפרטורה. פלטייה אלמנט בתא הקירור יכול גם לכסות טווח טמפרטורה רחב יותר (15-40 מעלות צלזיוס) מ setups הקלאסית, שבה הטמפרטורות להגיע כמו 15 מעלות צלזיוס או 40 ° C הוא מאוד קשה. Discoideum Dictyostelium הוא רגיש במיוחד רעילות צילום. מחקרים קודמים השתמשו ascorbate כמו נבלות להפחית רעילות צילום. עם זאת, תקופות הדמיה ארוכות דורשות תוספת נוספת. יתר על כן, השימוש ascorbate מוגבל ללימודים בהן מנגנון הריבית אינו מושפע תוסף נוגד חמצון. אנו מציעים כי הדמיה שבשליטת הטמפרטורה יכולה לשמש חלופה apprאוח למזער רעילות תמונה וניתן לשלבו עם תוספת של ascorbate להפחית רעילות נוספת. תופעות phototoxic ניתן למזער על ידי מתן טמפרטורה קבועה ואחידה של 23 ° C באמצעות תא קירור. תאים הדמיה באמצעות בקרת טמפרטורה להראות פחות סימנים של רעילות צילום, עיגול תא כזה, במשך פרק זמן ארוך יותר. זה גם מאפשר הדמיה עם עוצמות גבוהות, מרווחי זמן קטנים יותר או יותר שדות נוף (FOVs). יישום כללי עומס חום בטמפרטורות גבוהות הוכח לעורר תגובת לחץ חום שונה 14. לכן, הגדלת הטמפרטורה ל 34 מעלות צלזיוס או 37 ° C עלולה לגרום תגובה שונה. בנוסף לחץ הטמפרטורה מיושם, משך מצב מתח מסוים יכול להיות שונה כדי לחקור את התגובה המיידית או הסתגלות לטווח ארוך לחום מתח. באופן כללי, הפרוטוקול המתואר יכול להיותהתרחב מערך רחב של יישומים. מאחר בקרת הטמפרטורה המדויקת מפחיתה באופן משמעותי אפקטים לתמונה רעילה, הפרוטוקול ניתן להשתמש במסגרות הדורשות זמני חשיפה גבוהים ו / או עוצמות אור עירור גבוהות, למשל, המאפשרים הדמית חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה, או בשילוב עם מרווחי זמן קצרים בין הדמיה, למשל, במהלך ההדמיה זמן לשגות. זה גם יכול להיות יתרון עבור הדמיה חפצה פורש התא כולו, למשל, microtubules, כמו הגדרות אלה דורשים מספר גבוה של z-חלקים אופטיים.

Discoideum Dictyostelium הם אמבות בודדות חיים בקרקע הניזונים חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים, אשר נתפסים על ידי phagocytosis. יש לה מחזור חיים ייחודי מדהים כי כבר שטח גדול של מחקר מאז גילויו 1. הריבית בשלב המוקדמת של התפתחות רבה-תאית 2 ואת הבסיס המולקולרי של chemotaxis 3 הושלמה בקרוב על ידי מחקרי התמקדות תנועתיות תא, קוטביות בתא, חסינות מולדת. בנוסף, ד discoideum הוצג כמערכת מודל 4,5 המחקר הביו-רפואי. לאחרונה, הקמנו ד discoideum כמערכת חדשה ללמוד את בקרת איכות חלבון (PQC) 6,7 המערכת. Proteome שלה הוא מועשר בחלבוני צבירה נוטה כמו-פריון, אשר מציב אתגר בפני בקרת איכות חלבון 8. כדי לחקור האם ד discoideum פתחה מנגנונים מולקולריים מיוחדים לשלוט AG ביותר שלהgregation נוטה proteome חקרנו את ההתנהגות של חלבוני סמן נוטה צבירה הוא בתנאי צמיחה נורמלים במהלך מתח. בתנאי עקה, כגון עומס החום, שניתן להשתמש בהם כדי להגביר את קצב חלבון misfolding 9. לכן, חיפשנו מערכת שבה נוכל לגרום שינויי טמפרטורה ובמקביל לעקוב אחר ההתנהגות של חלבונים סמן. לשם כך, אנו בשילוב הדמית תא חי עם חימום מבוקר פלטייה באמצעות כנס במה תרמי (תא קירור). שיטה זו אפשרה לנו לשמור על טמפרטורה קבועה ואחידה וכן לגרום לשינוי טמפרטורה מהיר, עדיין מדויק. הדמית תא חי משמשת ללמוד מגוון של תהליכים ביולוגיים ד discoideum. עם זאת, גישה זו עומדת בפני שתי מגבלות עיקריות. ראשית, התאים להציג תנועתיות גבוהה נוטים להגר אל מחוץ לשדה הראייה, ובכך המעקב של תאים בודדים לעתים קרובות דורש הדמיה של שטח גדול. ניידות התא יכוללהיות מופחת על ידי כיסוי 10 אגרו, עם זאת, תנאים אלה אינם מתאימים הדמיה לטווח ארוכה בשל ירידה כדאיות. שנית, ד תאי discoideum להראות רגישות גבוהה במיוחד רעילות צילום, שתוצאתה עיגול תא מעצר mitotic 11. פרוטוקולים קודמים לטפל בבעיה זו על ידי תוספת של ascorbate כמחסל רדיקלי וצמצום חשיפה פעמים 12. האחרון יכול להיות קריטי אם החלבון של העניין מתבטא ברמות נמוכות ומראה אות קרינה חלשה. המחברים גם מציעים לספק טמפרטורה קבועה של 21 מעלות צלזיוס או על ידי הדמיה בחדר ממוזג או באמצעות תיבות דגירת בקרת טמפרטורה, אשר מכסות את הבמה האובייקטיבית מיקרוסקופ 12. כאן, אנו מתארים שיטה עם בקרת טמפרטורה משופרת באמצעות תא קירור נקבע על 23 מעלות צלזיוס. במהלך הדמית ההגדרה שלנו משפר באופן משמעותי את ההתנגדות רעילה צילום. זהמאפשר את השימוש של פעמי חשיפה גבוהות ועוצמות אור עירור גבוהות. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת במהלך ההדמיה זמן לשגות, כפי מרווחי הזמן צריך להיות מאוזן בקפידה מול מספר המשרות צילמו את זמן החשיפה לשמש. האפשרות להגדיל את מספר משרות צלמו גם מאפשרת כיסוי של אזור הדמיה רחב יותר ומקל מעקב של תאים בודדים על פני תקופה ארוכה של זמן.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

פרוטוקול ההדמיה המתואר יכול לשמש כדי לנתח את ההתנהגות של חלבוני צבירה נוטה כמו-פריון ב האמבה ד discoideum במהלך עומס חום. איור 1 מציג את התפלגות Q103 חלבון polyglutamine-tagged GFP בתאים בתנאי צמיחה נורמלים (איור 1 א), אחרי 2 שעות של עומס חום על 30 מעלות צלזיוס (איור 1B) ואחרי 6 שעות של התאוששות מתח צמיחה בתנאי צמיחה נורמלית (איור 1 ג). עם עליית טמפרטורה מ -23 ° C עד 30 ° C, סמן GFP-Q103 מתמזג מתוך הפצה מפוזרת כדי punctate מבנים. עם שחרורו וצמיחת לחץ בטמפרטורה רגילה, מבנים אלה לפזר. חלוקים מחדש של Q103-GFP ההיווצרות של מוקדי cytosolic חום הנגרמת מתח ניתן לכמת באמצעות ניתוח תמונה. איור 2 א מראה את ניתוח FOVs הבודד באמצעות פיג&#39;י ואת התוסף &quot;Cell לדלפק &quot;. איור 2B מראה את כימות של תגובת הלחץ החום. זה מראה כי גידול מוקדי Q103-GFP cytosolic במספרים עם עומס חום מתמשך. במהלך עקת חום, חלבון באיכות מלאה (PQC) המערכת הוא המום, ובכך aggregation- חלבונים נוטה כגון Q103 חלבון כמו-הפריון לא יכול להישמר במצב מסיס יותר ויותר המצרפי מוקדים cytosolic. התאים גם להראות עיגול מאפיין, כמתואר באיור 1B. צמצום מוקדי cytosolic לאחר הסרת הלחץ עולה כי מצטברים חלבונים הם מומסים. איכות ההדמיה רגישה צפיפות התא הראשונית. איור 3 מראה דוגמא של תאים לאחר התאוששות מתח, השוואת צפיפות תא ראשונית מתאימה (איור 3 א) ו צפיפות תא ראשונית גבוהה (איור 3). אם צפיפות התאים הראשונית היתה גבוהה מדי, כוכב תאיםטד כדי ליצור זרמי כמתואר איור 3B. זה המטיל קשיים על כימות הבאים בתור התאים עברו מן המטוס מוקד. השיטה המתוארת ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר שינויי מושרה טמפרטורה כפי שתואר לעיל. זה יכול לשמש גם כדי להפחית רעילות צילום כאשר הדמיה בטמפרטורת הצמיחה פיזיולוגי. איור 4 מציג השוואה של תא צילמו ב 23 מעלות צלזיוס (איור 4 א) תא הקירור ותאי צילמו ללא בקרת טמפרטורה בחדר ממוזג, להגדיר עד 25 ° C (איור 4B). עם חשיפה מתמדת לאור העירור, תאים לעגל כלפי מעלה כאשר לא צלמו בתנאי בקרת טמפרטורה. שינוי זה בצורת התא הוא המציין מתח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> איור 1: <s<html> טרונג&gt; חלבונים Aggregation נוטה כמו-הפריון לשנות ההפצה הסלולרי שלהם במהלך עומס החום. מתויג GFP אקסון huntingtin polyglutamine עשירי 1 (Q103) באה לידי ביטוי constitutively ב AX2-214 ד תאי discoideum (אות ה- GFP מתוארת בטבלת בדיקה גונית אפור הפוכה). (א) בתנאי צמיחה נורמלים ב 23 ° C, Q103-GFP מופץ מתפזר ברחבי הציטופלסמה. (ב) אחרי שעה 2 של עומס החום על 30 מעלות צלזיוס, Q103-GFP מתמזגת לתוך מוקדים cytosolic (חצים אדומים). התאים להראות שינוי צורה אופייני לעגל כלפי מעלה. (ג) עם שחרורו וצמיחה מתח ב 23 ° C, מוקדי cytosolic מתמוססים. לאחר 6 שעות, ללא מוקדים cytosolic ניתן לצפות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig2.jpg" /> איור 2: כימות של היווצרות מוקדי cytosolic חום נגרמת (א) ניתוח של תאים באמצעות החבילה בעיבוד תמונות חינם פיג&#39;י ואת התוסף &quot;מונה Cell&quot;.. הסכום הכולל של תאים (סוג 1, סמני דלפק כחולים) נקבע בתמונה בשדה הבהירה. הסמנים נטענים בערוץ-GFP ואת מספר התאים עם מוקדי cytosolic (סוג 2, סמני דלפק אדומים) נקבע. (ב) כימות של מוקדים לאחר 3 שעות של עומס החום על 30 מעלות צלזיוס ו -3 שעות של התאוששות מתח ב 23 ° C (n = 4 שדות מבט, שגיאה בר = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; איור 3: השפעת צפיפות התאים על הדמיה לטווח ארוך זמן לשגות (א) תאים צילמו בצפיפויות התא הראשוני &lt;10 5 תאים / מ&quot;ל.. אחרי 3 שעות של עומס חום על 30 מעלות צלזיוס ו -6 שעות של התאוששות מתח ב 23 ° C, תאים עדיין להישאר במחזור וגטטיבי ומתחלק. רק כמה תאים לצאת מישור המוקד. (ב) תאים צילמו בצפיפויות התא הראשוני&gt; 10 6 תאים / מ&quot;ל. לאחר 9 שעות של הדמיה (הגדרות כמו א), תאים נכנסו מעגל ההתפתחות והחל הזרמה וצבירה. תאים של המצרפים לא ניתן להבחין בבירור. חלק גדול של תאים יוצא המטוס מוקד ולא ניתן לנתח. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; איור 4:. השפעת בקרת טמפרטורה על תופעות phototoxic (א) תאים צילמו במשך 10 דק &#39;עם בקרת טמפרטורה ב 23 ° C: 6 שדות מבט, Z- מחסנית (ריווח 0.5 מיקרומטר, מדגם עובי 8 מיקרומטר), זמן לשגות (סה&quot;כ זמן 10 דקות, לשגות 1 דק &#39;), ערוץ GFP (0.07 זמן החשיפה msec, 10% עוצמת הלייזר), ערוץ RFP (0.1 זמן חשיפה msec, עוצמת הלייזר 10%). והתא לא מראה סימנים של שינויים מורפולוגיים מאפיין הקשורים ללחץ phototoxic. (ב) תאים צילמו במשך 10 דק &#39;ללא בקרת טמפרטורה (באותם תנאים כמו A). תאי מפגיני סימנים של עיגול מושרה phototoxic, המציין מתח. בר סולם = 10 מיקרומטר. התאים היו צלמו על מערכת המבוססת על מיקרוסקופ עם מטרת 100x / 1.4 צמצם מספרי (NA). התמונות נאספו עם מצלמת CCD כמו 1,024 x 1,024 קבצים פיקסל באמצעות 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging at JoVE.com

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K Views.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Video: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Biochemistry

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Neuroscience

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Bioengineering

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של