פרויקט זה מומן על ידי Case Western Reserve University קרנות ההפעלה הניתן E. העליז. חלזונות אינפקטד סופקו על ידי מרכז משאבים Schistosome, NIH-NIAID (NIAID חוזה מס &#39;HHSN272201000009I). אנו מודים גם כריס המלך רונלד בלנטון תמיכה באבטחת חלזונות schistosome נגוע לדיונים מועילים.

אמצעי בטיחות: Cercariae Schistosome יכול לחדור את העור ישירות ללא לצרכים של חתך או נקבוביות, ולגרום schistosomiasis מחלה כרונית. S. mansoni הוא 2 רמת biosafety האורגניזם, ולכן מתאים ציוד מגן אישי ואמצעי בטיחות נאותה חייב להיות אחריו כאשר עובדים עם cercaria זיהומיות. רוב הציוד הדרוש לגדול ולהפוך schistosomes הוא רגיל, עם כמה יוצאים מן הכלל מפתח ציין בטבלה בסוף הפרוטוקול. כל עבודה cercarial צריך להיעשות בחדר מבודד. Schistosomules צריך להיות תרבותי ברדס סטרילי, biosafety אושרה. שתי שכבות של כפפות גומי או nitrile יש ללבוש, כמו חלוק מעבדה, זוג עמיד למים של נעליים, מכנסיים, ללא חורים או דמעות, מגיני שרוול אטום על פרק כף היד והזרועות צריכים. במקרה של דליפת מקרי, מיד לרסס שטח מזוהם עם אתנול 70% או 10% אקונומיקה, שפשוף נמרץ אם על האדם שלך. זה יהיה מספיק כדי לנטרל את הטפיל, אבל כל זיהום אפשרי צריך להיות מדווחים ברצינות. למרות schistosomules אינם מולד זיהומיות, הנחיות מוסדיים להשתנות, יש להתייעץ עם כדי לקבוע אם BSL2 אמצעי זהירות נדרשים בשלבי החיים noninfectious. לחטא את כל המשטחים אשר באים במגע עם כל חומר זיהומיות פוטנציאלי לאחר הניסוי מתבצע ולסלק פסולת במיכל Biohazard אושרה. הערה: חילזון כיסוי מארח פחי 1-2 ימים לפני שפיכת ולהגן מפני אור 1. מסיק cercariae מהמחשב המארח חילזון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס נקייה, 500ml ללא דטרגנטים מלא באמצע עם מים מזוקקים equilibrated לטמפרטורת החדר. אם עובדים עם חלזונות מארח נגוע miracidia בתאריכים שונים, השתמש כוס נפרדת עבור כל תאריך זיהום (הדבר חשוב במיוחד אם חלזונות יהיה לעשות בה שימוש חוזר עבור ניסויים בעתיד). גודל הכוס יכול גם להיות קטן בהתאם החוויה של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף המארחים חילזון נגוע אתה רוצה לשפוך בזהירות להפקיד אותם בכוס באמצעות הדגים באקווריום סטנדרטי נטו מלקחיים למטרות כלליות לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוס מניחים על מגש לשפוך חירום כ 8-12 ס&quot;מ מתחת למקור ליבון קל. בואו לעמוד על 1-2 שעות תחת האור. Cercariae יציאה המארח חילזון בעת ​​חשיפה לאור בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסנן חלזונות מתערובת cercariae. קח אמצעי בטיחות נוספים, כמו תערובת היא מדבקת מאוד. זכור, cercariae יכולים לחדור ישירות לעור אנושי! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תערובת תחת מקור אור למשך כ 15 דקות, מה שמאפשר לכל עניין פסולת החלקיקים להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת cercariae לתוך בקבוק Erlenmeyer נקי באמצעות pipet, הימנעות פסולת בתחתית הכוס. מניחים את הבקבוק על כ זווית של ° 45 על הקרח בחושך במשך 45-60 דקות, המאפשר cercariae להתיישב לפינה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet 50 מ&quot;ל להסיר 75-90% מכלל supernatant לבין הפקדת אותה כוס אקונומיקה המכיל 10% או 70% אתנול, נזהרת שלא לתת טיפות מים המכילים לטפטף cercariae מ pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת את הבקבוק המכיל Erlenmeyer cercariae בעדינות resuspend cercariae בתמיסה. השתמש pipet להעביר את המדגם ל -50 מ&quot;ל סטרילי צינורות חרוטי. המקום צינורות שוב על קרח למשך 20 דקות בחושך. Cercariae יישב כלפי התחתון של הצינור בחושך. </li></ol> 2. שינוי ידני של cercariae כדי schistosomules לפני שתתחיל: ודא RPMI 1640 מלאה (RPMI, 5% בסרום שור עוברית, 1X פן / סטרפטוקוקוס) וחם על 37 ° C. (זה חיוני כי בסרום שור העובר בשימוש כבר מומת על ידי דגירה של 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כמו schistosomes יכולים להיות רגישים כדי להשלים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף Biohazard, להסיר supernatant עד 5 מ&quot;ל עד 10 מתוך פתרון בכל חרוטי 50 מ&quot;ל באמצעות pipettor או מכשיר ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מד 22 פעמיים הסתיים, luer Lok emulsifying המחט במזרק בגודל מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לשאוב תערובת לתוך המזרק. איסוף cercariae מכל 50 צינורות מ&quot;ל מזרק. היו קשובים שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפוך מזרק על כך שסוף מחט פנויות תלוי. צרף עוד המזרק בצד הזה של המחט emulsifying. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את התערובת דרך המחט בסך הכל 40 פעמים (20 פעמים הלוך ושוב) להפוך את cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את במאונך כגון מזרקים כי תערובת הכלול מזרק התחתונה את המזרק העליון ריק. הסר את המזרק העליון לחטא ב 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת הפקדה טיפה אחר טיפה לתוך נקי גבוה צלחת חומה 100mm x 50mm פיירקס או צלחת גיבוש. לחטא מחט המזרק אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 37 ° C 1640 RPMI התקשורת להשלים כזהתחתית הצלחת פטרי מכוסה לחלוטין, כאילו שופך צלחת מרק לוריא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות כדי לאסוף schistosomules במרכז צלחת פטרי. הימנע התזה. הערה: זה יכול להיות שימושי כדי לכבות את האור מכסה המנוע של שלב זה בצורה נכונה יותר לדמיין את schistosomules במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להפקיד schistosomules מרוכז לתוך צלחת תא טרי 12 גם בתרבות גם באמצעות טפטפת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.9 ו - 2.10 עד schistosomules אינם מציגים במרכז צלחת (כ 10 פעמים). הפקדה כל אוסף הבאים בבאר טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא כל טוב באמצע הדרך (~ 1.5 מ&quot;ל) עם prewarmed התקשורת RPMI להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו על מיקרוסקופ הפוך לאמת את הנוכחות של schistosomules והיעדר cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את schistosomules ב CO 2 באינקובטור מוגדר 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. נציג תוצאות: העברת בהמתנה של schistosomules הופכת התקשורת לתרבות, ויזואליזציה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוכה (ראו טבלה ציוד למשל) אמור להניב תמונה דומה באיור 1, שבו רק schistosomules הפך נמצאים הבאר. מזהמים פוטנציאליים יכול לכלול cercariae שלם, זנבות cercarial ניתק, או פסולת אחרת. אם לא מיקרוסקופ הפוכה זמין, מיקרוסקופ רגיל או אפילו היקף דיסקציה יהיה מספיק כדי להמחיש את schistosomules. שים לב כי נוהל זה אינו תמיד להפוך 100% cercariae. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1: Schistosomulum שינו <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2: Cercariae וזנבות הכרות

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעיות פוטנציאליות כמה יכול להיווצר במהלך הליך השינוי, אולם בפרוטוקול זה נועד למנוע את רוב הבעיות הללו. אחת סכנה פוטנציאלית היא סתימת המחט emulsifying, אשר בדרך כלל עולה בשל פסולת שנשאר מן קצירת בשלב 1.3. הקפידו לאפשר לכל חומר חלקיקי להתיישב צעד 1.5 ולהעביר את cercariae בזהירות בשלב 1.6 כדי למנוע בעיה זו. כמו כן, כפי שתואר קודם לכן, עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שימוש בציוד מגן אישי (גם מגן פנים) והימנעות של לחץ מוגזם על המזרקים רצוי. זנבות cercarial משפחתי ניתן דמיינו בכלי התקשורת, אשר מעיד על ההפרדה עניים במהלך שלב 2.9. זנבות התערוכה תנועה התכווצות דמויי יש צורה ברורה (ראו תרשים 2), thusly וניתן להבחין בקלות schistosomules. זנבות ניתן להסיר על ידי שטיפת schistosomules עודף של RPMI שלם המאפשר schistosomules להתיישב. זנבות יישאר צף והוא יכול להיות שאב משם. אם cercariae שלם נוכחים בתקשורת, השינוי בשלב 2.5 לא בוצעה כראוי. תמונה של cercaria שלם מתואר באיור 3b לעיון. אם בעיה זו מתרחשת, להבטיח את המחט emulsifying בשימוש הוא בגודל הנכון. כמו כן, מספר פעמים את התערובת cercarial עובר דרך המחט ניתן להגדיל, אם כי 40 פעמים הוא בדרך כלל הרבה יותר מאשר מספיק כדי להתקרב הגז 100% של זנבות cercarial. טרנספורמציה של cercaria לתוך schistosomules תוארה לראשונה על ידי קולי ו Wikel (13) בשנת 1974. מאז, הכנת schistosomules נעשה שימוש או אסטרטגיה הגז עם מחט ומזרק כמתואר בפרוטוקול זה, או באמצעות גישה vortexing ומופרד עם מילויים של percoll (14, 15) או מתערבל כפי שמודגם במאמר זה. אלה שתי טכניקות schistosomules הכנת מתוארים להפליא על ידי פרד לואיס (16) ומידע נוסף עבור culturing schistosomules נוספת של צמיחה לטווח ארוך ניתן למצוא משאבים NIAID מרכז Schistosome ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;מחט emulsifying </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 1X בינוני (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) חום מומת </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> תבשיל גיבוש (100mm) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> מטרת מלקטת כללי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco אקווריום הנקי ארטמיה </td><td> Petco </td><td> מק&quot;ט: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

טפילים Schistosome הם סוכני סיבתי של schistosomiasis, מחלה כרונית מתישה המשפיעה על מעל 200 מיליון אנשים ברחבי העולם ומדרגת השנייה מלריה בקרב מחלות טפיליות במונחים של בריאות הציבור חברתי כלכלי ההשפעה (1-4). טפילים Schistosome הם תולעים trematode עם מחזור חיים מורכב interchanging בין חיים טפילי ב המארחים molluscan ו יונקים עם התערבות חופשי שחייה שלבים. בקצרה, חופשי שחייה cercariae להדביק מארח יונקים ידי חודר את העור בעזרת פרוטאזות מופרש, במהלכן cercariae מאבדים את זנבותיהם, והופך schistosomules. Schistosomules חייב עכשיו להתחמק ממערכת החיסון המארח, לפתח בטן לעיכול של כדוריות דם אדומות, ולהעביר למרות הריאות ומחזור הדם הפורטל בדרכם ליעדם הסופי במערכת הפורטל הכבד, ובסופו של דבר הוורידים mesenteric (עבור ס mansoni) שם זכר ונקבה זוג תולעים ו להזדווג, ייצור מאות ביצים ביום. חלק מן הביצים מופרשים מהגוף לתוך מים מתוקים, שם הביצים בוקעות חופשי שחייה miracidia (50-10). Miracidia להדביק מינים חילזון ספציפיים להפוך sporocysts אם ובתה, אשר בתורו, לייצר cercariae זיהומיות, השלמת מחזור החיים. למרבה הצער, מחזור חיים שלם schistosome לא יכול להיות מתורבת במבחנה, אך cercariae זיהומיות ניתן להפוך schistosomules, ואת schistosomules יכול להיות מתורבת במשך שבועות לניתוח התפתחות schistosome במבחנה או ניתוח microarray. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור חזותי של טרנספורמציה cercarial ו culturing במבחנה של schistosomules. אנו לשפוך cercariae זיהומיות מן glabrata מארח חילזון Biomphalaria באופן ידני ולהפוך אותם schistosomules על ידי ניתוק זנבותיהם באמצעות emulsifying פעמיים הסתיים מחט. במבחנה cercarial שינוי וטכניקות schistosomules תרבות תיאר להימנע משימוש לארח יונקים, אשר מפשט להדמיה של schistosomes ומקל על אוסף של הטפיל לניתוח ניסיוני. בשינוי במבחנה טכניקות culturing של schistosomes נעשו במשך שנים (11, 12), אבל אין פרוטוקולים חזותי פותחו הזמינים הקהילה כולה.

Watch this Scientific Journal Video about Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules at JoVE.com

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

אנו מתארים<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטת schistosomula culturing של טפיל התולעת השטוחה<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, באמצעות קצירת וטרנספורמציה של cercariae זיהומיות של חילזון הטרי מים glabrata מארח ביניים Biomphalaria.

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

18.0K Views.  Case Western Reserve University. אנו מתארים במבחנה שיטת schistosomula culturing של טפיל התולעת השטוחה Schistosoma mansoni, באמצעות קצירת וטרנספורמציה של cercariae זיהומיות של חילזון הטרי מים glabrata מארח ביניים Biomphalaria.

Video: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...