وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل ريزيرف الأموال الغربية التي قدمت إلى جامعة بدء التشغيل E. جولي. وقدمت القواقع المصابة من قبل مركز المعلومات البلهارسيا ، NIH - المعدية (NIAID العقد رقم HHSN272201000009I). كما نشكر جلالة الملك وكريس رونالد بلانتون للحصول على الدعم في تأمين القواقع المصابة والبلهارسيا لإجراء مناقشات مفيدة.

تدابير السلامة : يمكن cercariae البلهارسيا اختراق الجلد مباشرة من دون حاجة لخفض أو المسام ، وتسبب مرض البلهارسيا من الأمراض المزمنة. S. المنسونية هو مستوى السلامة الحيوية 2 الكائن ، وبالتالي السليم معدات الحماية الشخصية ويجب اتباع تدابير السلامة المناسبة عند العمل مع المذنبات المعدية. معظم المعدات اللازمة للنمو وتحويل البلهارسيا هو المعيار ، مع وجود استثناءات قليلة لاحظت المفتاح في الجدول في نهاية البروتوكول. وينبغي القيام بجميع الأعمال بالمذنبات في غرفة منعزلة. وينبغي أن المثقف Schistosomules في العقيمة ، وافق هود للسلامة الأحيائية. وينبغي أن ترتديه من طبقتين أو النتريل قفازات مطاطية ، كما ينبغي أن معطف المختبر ، وزوج من الأحذية للماء ، والسراويل مع عدم وجود ثقوب أو الدموع ، وحماة الأكمام ماء لمعصميك والأسلحة. في حالة وجود تسرب عرضي ، رش المنطقة الملوثة فورا مع الايثانول 70 ٪ أو 10 ٪ التبييض ، وفرك بقوة إذا كان على الشخص الخاص. هذا سوف يكون كافيا لتعطيل الطفيلي ، ولكن ينبغي الإبلاغ عن جميع حالات العدوى المحتملة وتؤخذ على محمل الجد. على الرغم من schistosomules ليست معدية بالفطرة ، والمبادئ التوجيهية المؤسسية تختلف ، وينبغي استشارة لتحديد ما إذا كان يلزم BSL2 الاحتياطات خلال مراحل الحياة غير المعدية. تطهير جميع الأسطح التي تتلامس مع أي مادة قد تكون معدية بعد تنفيذ التجربة والتخلص من النفايات في حاوية an بيولوجية المعتمدة. ملاحظة : صناديق غطاء الحلزون المضيف 1-2 قبل أيام من إلقاء الضوء وحمايتها من 1. حصاد cercariae من المضيف الحلزون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل نظيف وخال من دورق 500mL المنظفات الكامل في منتصف الطريق مع الماء المقطر معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة. إذا كان يعمل مع القواقع المضيفة المصابين miracidia في تواريخ مختلفة ، واستخدام كوب منفصلة لكل تاريخ العدوى (وهذا أمر مهم لا سيما إذا كان سيتم استخدامها لاجراء تجارب على القواقع في المستقبل). يمكن حجم الدورق أيضا أن تكون أصغر اعتمادا على تجربة المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستضيف جمع القواقع المصابة ترغب في إلقاء ودائع بعناية في الدورق باستخدام معيار صافي أسماك الزينة وملقط الغرض العام حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درج دورق مكان على بقعة الطوارئ حوالي 8 إلى 12 بوصة تحت مصدر ضوء ساطع. اسمحوا الوقوف لمدة 1-2 ساعات تحت الضوء. Cercariae خروج المضيف الحلزون عند التعرض لضوء ساطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية بعناية القواقع من خليط cercariae. اتخاذ احتياطات السلامة الإضافية ، كما هو مزيج شديد العدوى. تذكر ، cercariae يمكن ان تخترق الجلد مباشرة الإنسان! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المخلوط تحت مصدر الضوء لمدة 15 دقيقة ، مما يسمح أي مسألة النفايات الجسيمات إلى تسوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل cercariae في دورق مخروطي نظيف باستخدام الماصة ، وتجنب الحطام في قاع الكأس. ضع قارورة في حوالي زاوية 45 درجة على الجليد في الظلام لمدة 45 -- 60 دقيقة ، مما يسمح لتسوية cercariae في زاوية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة 50 مل لإزالة 75-90 ٪ من طاف وايداعها في دورق يحتوي على مواد التبييض 10 ٪ أو 70 ٪ من الإيثانول ، مع الحرص على عدم السماح لقطرات المياه التي تحتوي على بالتنقيط cercariae من الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة في دورق مخروطي يحتوي على cercariae برفق لresuspend في cercariae في الحل. استخدام الماصة لنقل العينة إلى أنابيب معقمة مل 50 المخروطية. مكان الأنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. سوف Cercariae تسوية نحو الجزء السفلي من أنبوب في الظلام. </li></ol> 2. دليل لتحويل cercariae schistosomules قبل البدء : قم RPMI 1640 كاملة (RPMI ، 5 ٪ مصل بقري جنيني ، 1X القلم / بكتيريا) ودافئة إلى 37 درجة مئوية. (ومن الأهمية بمكان أن تم المعطل المصل البقري الأجنة المستخدمة من قبل الحضانة a 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والبلهارسيا يمكن أن تكون حساسة لتكملة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قلنسوة واقية ، وإزالة طاف وصولا الى 5-10 مل من الحل في كل مخروطية 50 مل باستخدام pipettor أو جهاز فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق قياس 22 المزدوج انتهت ، luer لوك الاستحلاب الإبرة إلى حقنة بحجم مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم ببطء الخليط في المحاقن. جمع cercariae من جميع الأنابيب في 50 مل حقنة. تكون منتبهة لنازف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره عبر حقنة بعناية بحيث نهاية الإبرة غير مرتبط متروك. حقنة أخرى نعلق على هذا الجانب من الإبرة الاستحلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير الخليط من خلال إبرة ما مجموعه 40 مرات (20 مرات ذهابا وإيابا) لتحويل cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف مثل المحاقن عموديا محتواة الخليط في المحقنة القاع ورأس المحقنة فارغة. إزالة وتطهير حقنة الأعلى في الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض مزيج الودائع قطرة في ارتفاع الجدران نظيفة طبق بيركس س 100mm 50mm أو صحن بلورة. تعقيم الإبر والمحاقن في الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 37 درجة مئوية RPMI 1640 كاملة وسائل الإعلام هذه أنغير مغطاة بالكامل الجزء السفلي من طبق بيتري ، كما لو صب طبق مرق لوريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة برفق لجمع schistosomules في وسط صحن بتري. تجنب الرش. ملاحظة : قد يكون مفيدا لإيقاف ضوء غطاء لهذه الخطوة إلى مزيد من كاف تصور schistosomules في المركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع فورا schistosomules تتركز في الطازجة جيدا الخلية 12 لوحة الثقافة جيدا باستخدام قطارة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 2.9 و 2.10 حتى schistosomules لم تعد موجودة في وسط الطبق (حوالي 10 مرات). إيداع كل مجموعة لاحقة في بئر جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر يصل في منتصف الطريق (~ 1،5 مل) مع وسائل الاعلام RPMI prewarmed كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور على مجهر مقلوب للتحقق من وجود وعدم وجود schistosomules cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو في حاضنة schistosomules CO 2 تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li></ol> 3. ممثل النتائج : وينبغي نقل بانتظار تحويلها إلى وسائل الإعلام schistosomules الثقافة والتصور تحت مجهر مقلوب مشرق الميدان (انظر الجدول معدات للحصول على مثال) العائد صورة مشابهة إلى الشكل 1 ، الذي تحول schistosomules فقط موجودة في البئر. يمكن أن تشمل الملوثات المحتملة cercariae سليمة ، والذيول بالمذنبات قطعت ، أو غيرها من الحطام. إذا لم يتوفر مجهر مقلوب ، وسوف المجهر القياسية أو حتى على نطاق تشريح تكون كافية لتصور schistosomules. علما أن هذا الإجراء لا يحول دائما 100 ٪ من cercariae. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : تحولت Schistosomulum <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : Cercariae والذيول المجزأة

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يمكن أن تنشأ عدة مشاكل محتملة أثناء إجراء التحويل ، إلا أن هذا البروتوكول يهدف إلى تفادي معظم هذه المشاكل. أحد الأخطار المحتملة هو انسداد الإبرة الاستحلاب ، والذي ينشأ عادة بسبب الحطام التي خلفها الحصاد في الخطوة 1.3. تأكد من السماح لجميع الجسيمات ليستقر في الخطوة 1.5 و لنقل cercariae بعناية في الخطوة 1.6 لتجنب هذه المشكلة. أيضا ، كما هو موضح من قبل ، والعمل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، واستخدام معدات الحماية الشخصية (حتى دروع لحماية الوجه) ، وتجنب الضغط الزائد على المحاقن مستحسنة. يمكن فصل بالمذنبات ذيول يمكن تصور في وسائل الإعلام ، مما يدل على الفقراء خلال فصل الخطوة 2.9. ذيول يحمل اقتراحا مثل تشنج ولها شكل متميز (انظر الشكل 2) ، ويتم تمييزها بسهولة thusly من schistosomules. يمكن إزالة ذيول بواسطة غسل schistosomules تتجاوز RPMI كاملة schistosomules السماح لتسوية. وسوف تظل عائمة ذيول ويمكن إيقاف بالمكنسة الكهربائية. إذا cercariae سليمة موجودة في وسائل الإعلام ، لم ينفذ هذا التحول في الخطوة 2.5 بشكل صحيح. ويصور مشهدا لالمذنبات سليمة في الشكل 3B كمرجع. إذا كانت هذه المشكلة ، التأكد من أن الإبرة الاستحلاب المستخدمة هي من الحجم المناسب. أيضا ، يمكن زيادة عدد المرات التي يتم تمريرها من خلال خليط بالمذنبات الإبرة ، على الرغم من 40 مرة هو عادة أكثر بكثير مما يكفي لتقترب من 100 ٪ من قص ذيول بالمذنبات. وكان أول وصف التحول من المذنبات في schistosomules في عام 1974 وWikel كولي (13). منذ ذلك الحين ، أنجز إعداد schistosomules باستخدام استراتيجية القص مع الإبر والمحاقن على النحو المبين في هذا البروتوكول ، أو باستخدام نهج vortexing والمنفصلين مع تدرجات لpercoll (14 ، 15) أو تحريكها كما هو موضح في هذه الورقة. موصوفة بجمال هذه التقنيات اثنين من أجل التحضير لويس schistosomules فريد (16) ولمزيد من المعلومات عن زراعة مزيد من schistosomules للنمو على المدى الطويل يمكن العثور عليها في مركز الموارد البلهارسيا المعدية ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto - resource.org</a> ).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> 22g س 2-7/8 &quot;إبرة الاستحلاب </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-825 - 17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 1X متوسطة (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) الحرارة المعطل </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستبرتوميسين (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> بلورة الطبق (100mm) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 08 - 741D </td></tr><tr><td> الملقط للأغراض العامة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 10 - 316C </td></tr><tr><td> بتكو ماء صافي الأرتيميا </td><td> بتكو </td><td> SKU : 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

طفيليات البلهارسيا هي العوامل المسببة للمرض البلهارسيا ، وهو مرض مزمن يؤثر على المنهكة أكثر من 200 مليون شخص حول العالم ويحتل المرتبة الثانية بعد الملاريا من بين الأمراض الطفيلية في مجال الصحة العامة وآثار اجتماعية واقتصادية (1-4). طفيليات البلهارسيا والديدان مثقوبة مع دورة حياة معقدة تتبادل بين الحياة الطفيلية في الثدييات والرخويات المضيفين مع التدخل السباحة الحرة مراحل. لفترة وجيزة ، حرر السباحة cercariae تصيب مجموعة الثدييات عن طريق اختراق الجلد مع المعونة من البروتياز يفرز ، خلال الوقت الذي تفقد cercariae ذيولها ، تتحول schistosomules. يجب أن تهرب الآن schistosomules النظام المضيف المناعي ، ووضع القناة الهضمية للهضم من خلايا الدم الحمراء ، وعلى الرغم من أن ترحيل الرئتين والدورة الدموية بوابة طريقها إلى وجهتها النهائية في الكبد ونظام البوابة في نهاية المطاف الأوردة المساريقي (لS. المنسونية) حيث الذكور والإناث والديدان لم الزوج ، وتنتج مئات من البيض يوميا. تفرز بعض البيض من الجسم في المياه العذبة ، حيث يفقس البيض في السباحة الحرة miracidia (5-10). وتصيب أنواع القواقع miracidia محددة وتحويلها الى sporocysts الأم وابنتها ، والتي بدورها ، تنتج cercariae المعدية ، واستكمال دورة الحياة. للأسف ، لا يمكن كامل دورة حياة البلهارسيا يمكن تربيتها في المختبر ، ولكن يمكن أن تتحول إلى عدوى cercariae schistosomules ، ويمكن تربيتها في schistosomules لأسابيع لتحليل التنمية البلهارسيا في المختبر أو تحليل ميكروأري. في هذا البروتوكول ، ونحن نقدم وصفا للتحول بالمذنبات البصرية واستزراع schistosomules المختبر. تسلط علينا من cercariae المعدية ذات السرتين الجرداء الحلزون المضيف وتحويل يدويا لهم في فصل schistosomules التي ذيولها باستخدام الاستحلاب المزدوج انتهت الإبرة. وصف التحول في المختبر بالمذنبات وتقنيات الثقافة schistosomules تجنب استخدام مجموعة الثدييات ، والذي يبسط التصور من البلهارسيا ويسهل جمع الطفيلي للتحليل تجريبي. التحول في المختبر وتقنيات زراعة من البلهارسيا وقد تم القيام به لسنوات (11 ، 12) ، ولكن لم توضع بروتوكولات البصرية التي تتوافر للمجتمع الدولي بأسره.

Watch this Scientific Journal Video about Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules at JoVE.com

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

نحن تصف<em&gt; في المختبر</em&gt; طريقة لزراعة schistosomula من الطفيليات دودة مسطحة<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ، عن طريق التحول من الحصاد وcercariae معدية من حلزون المياه العذبة وسيطة ذات السرتين الجرداء المضيف.

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

18.0K Views.  Case Western Reserve University. نحن تصف في المختبر طريقة لزراعة schistosomula من الطفيليات دودة مسطحة البلهارسيا المنسونية ، عن طريق التحول من الحصاد وcercariae معدية من حلزون المياه العذبة وسيطة ذات السرتين الجرداء المضيف.

Video: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

باستخدام بويضات من<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نموذج من التهاب الرئة الناجم عن الديدان الطفيلية

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Developmental Biology

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

النقل العابر للأشكال القوية من المشوكات الحبيبية

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genetics

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

توليد الجينات والضربة القاضية في أنواع Strongyloides عن طريق الحقن المجهري

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Biology

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

باستخدام بويضات من