פרויקט זה מומן על ידי NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, 0079874 #), תוכנית טכנולוגיה מתקדמת טקסס (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), טקסס A &amp; M Research Foundation, הפקולטה למדעי המחשב והנדסה באוניברסיטת טקסס A &amp; M האוניברסיטה, 3Scan. ברצוננו להודות ברנרד Mesa (Micro Star Technologies) להתייעצות ותמיכה טכנית עבור מכשור KESM. החלקים העיקריים של התכנון והיישום של KESM נעשה על ידי ברוס ח מקורמיק, שנפטר בשנת 2007.

1. הכנת הדגימה: Golgi-Cox <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מקרוב אחרי פרוטוקול של Mayerich et al. 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר C57BL/6J הוא מורדם באמצעות הרדמה עמוקה נשימתית isoflurane ו ערופה אז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא הסיר והניח לתוך פתרון Golgi-קוקס קיבעון (1% אשלגן כרומטי, dichromate אשלגן 1%, ו כלוריד כספיתי 1% במים deionized). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא נשאר פתרון Golgi-קוקס בחושך, בטמפרטורת החדר, במשך 10 עד 16 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוחות הם ושטף במים deionized לילה בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח ושטף הוא שקוע בפתרון 5% אמוניום הידרוקסיד במים deionized במשך 7 עד 10 ימים בחושך בטמפרטורת החדר. הפעם היה הכנה ממושכת כדי להבטיח חדירה של המוח כולו, כך נמהרת שחור היה סיכוי לחלוטין צורה ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא שטפה שוב בטמפרטורת החדר במים deionized במשך 4 שעות ו t50% ו 70% במקרר (4 ° C), ו - 85%, 95% (3 שינויים), ו -100% (4-5 שינויים) בטמפרטורת החדר: מיובש דרך סדרה מדורגת של אתיל אלכוהול תרנגולת. המוח הוא נשאר פתרון עבור כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח מיובש הוא לשים אז אצטון (3-4 שינויים, כל יום אחד), ואחריו תערובת araldite-אצטון עם יחס araldite ל-אצטון של 01:02, 01:01, 02:01, ולבסוף araldite 100% (3 שינויים, כל פעם במשך הלילה), במקרר (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, במוח המטופל מוטבע araldite 100% מחומם ל 60 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (ראה פרוטוקול הטבעה של אבוט Sotelo 2). אם דגימות המוטבעים LR הלבן ואז דגימות מועברים מפתרון אתנול האחרון 100% באמצעות שלושה שינויים של פתרון הלבן LR, כי הם כל הזמן במקרר למשך הלילה, שהוא הליך סטנדרטי לקראת פילמור. שלושה שינויים נעשים כדי להבטיח חדירה מלאה. הדגימה היא לאתרנגולת הועבר טרי LR הלבן כי הוא polymerized בכלי סגור ב 60 ° C למשך 24 שעות, המהווה את הסכום הנדרש של זמן וטמפרטורה של פילמור תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איור. 1 מראה המוח Golgi-קוקס מוכתם מוטבע Araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלוק הדגימה נרפא מותקן אז על טבעת המתכת הדגימה באמצעות אפוקסי, והצדדים של גוש גזוז לפי הצורך (ראה איור. 2). </li></ol> 2. הכנת הדגימה: Nissl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא מורדם באמצעות עמוק קטמין ו xylazine (1.7 מ&quot;ג קטמין / 0.26 xylazine מ&quot;ג לכל 20 גרם משקל גוף) intraperitoneally מוזרק ואז perfused transcardially באמצעות 50 מ&quot;ל של בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (pH 7.4), ואחריו 250 מ&quot;ל של החדר טמפרטורה של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין (pH 7.4). ולבסוף עם 3.0 סמ&quot;ק של דיו הודו חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף גוף שלמות עם מלח ו מקבע יש צורך לנקות את הדם ממערכת הלב וכלי הדם כדי לתקן את טי<html> ssues. זלוף בדיו הודו יש צורך לחלוטין למלא את כלי הדם של מערכת הלב וכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח וכתוצאה מכך הוא מיובש אז דרך סדרה של ציון אתיל אלכוהול (25% -100%) ו מוטבעים אז פלסטיק araldite בעקבות פרוטוקול של 1.8-1.9 לעיל. אם LR לבן הוא המדיום הטבעה אז פרוטוקול ב 1.10 לעיל אחריו. </li></ol> 4. הכנת הדגימה: מינים גנרי, איברים גנריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המקרה גנריות, קיבוע ניתן לעשות גם עם paraformaldehyde 10% שנאגרו נייטרלי% פורמלין או 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אמצעי אחסון רקמה קטן, דיפוזיה במקום זלוף מומלץ קיבעון ו מכתים. במקרה של אורגניזמים או איברים קטנים, מכתים גם ניתן לעשות בתהליך התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול הטבעה זהה לעיל, אם כי פעמים חדירה הפתרון יכול להיות מופחת עבור איברים או אורגניזמים קטנים בהרבה במוח העכבר כולו. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. KESM ההתקנה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המשאבה, בתורו על הבמה, להדליק מצלמה, להדליק את הפנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים סכין אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת טבעת הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימה מדוד מימד ליצור קובץ תצורה עבור היישום KESM שלב Controller2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל KESM שלב Controller2 ו לאתחל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין תחתון / אובייקטיבי, להפעיל את המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס אובייקטיבי המצלמה, על ידי סיבוב ידית התמקדות הרכבת אופטיים התאמת השדה של המצלמה להציג יחסית קצה הסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על [עבור] ליזום הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה תאנים. 3-8. ראה 9, 7 לפרטים טכניים. </li></ol> 6. עיבוד תמונה והכנת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את סטאק KESM הפעלה מעבד לתוך תיקיית הנתונים תחת התיקיה את קובץ הקונפיגורציה (00,000, 00,001 וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מעבד סטאק KESM להסיר חפץ תאורה לנרמל את עוצמת רקע כלתמונות. חזור על הפעולה עבור כל תיקיות המשנה נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו אריחים multiscale מהנתונים להגדיר ולהעלות והקים את הקבצים לשרת אטלס KESM המוח האינטרנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור. 9. </li></ol> 7. נתונים להדמיה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה באמצעות אטלס המוח KESM. עבור <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> ובחר אטלס המתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט כמו ב-Google Maps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום פנימה והחוצה כמו ב-Google Maps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבור אל עומק אחר, בחר כמה עמוק ללכת בכל שלב מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן לחץ על או [+] או [-] כדי להגדיל או להקטין עומק z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מספר כיסוי באמצעות התפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המרווח כיסוי באמצעות התפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור. 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה באמצעות MeVisLab. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקת MeVisLab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פרוייקט חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחודש הבא, מודולים חדשים ניתן ליצור על ידי tyפינג בשם מודול בתיבה פקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [Compose3Dfrom2DFiles], וללכת אל התיקיה הרצויה. הזן מחרוזת הקובץ לחץ [GetFileList]. ודא את התמונות הנבחרות יכול להתאים בזיכרון. לחץ [Create3D] כדי ליצור נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [SetWorldMatrix], וכן להגדיר את &quot;סולם&quot; תחת &quot;הופך היסודי&quot; x, y, z לגודל voxel המתאים (0.6, 0.7, 1.0 למטרה 0.45NA 10X). קישור [Compose3Dfrom2DFiles] ל [SetWorldMatrix]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט מטריקס הופכת תחת &quot;הרכב מטריקס&quot; ל &quot;התעלם&quot;, &quot;התעלם&quot;, &quot;קדימה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [Arithmetic1] וקבע את &quot;פונקציה&quot; על &quot;הפוך (Max-IMG)&quot;. קישור [SetWorldMatrix] ל [Arithmetic1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [View3D] וחבר [Arithmetic1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב View3D, בעוד הלחצן הימני של העכבר לחוץ, הזז את העכבר מסביב כדי להתאים את הסף. אתה יכול לחתוך אזורים, נטייה לשנות (להזיז את העכבר בזמן לחצן העכבר השמאלי לחוץ), לשנות את התאורה (renderin נפחגרם או MIP), להפוך on / off רקע, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור. 10. </li></ol></li></ol> 8. נציג תוצאות: כאן, אנו מציגים המוח כולו נתונים ופרטים. תאנים. 12-15 להראות המוח כולו הודו דיו, Golgi, ונתונים Nissl סטים 1, 4, 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" /> באיור 1. במוח העכבר קבוע, מוכתם, ומוטבעים <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" /> באיור 2. Embedded המוח הדגימה עכבר רכוב על טבעת את הדגימה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" /> באיור 3. סכין The Edge סריקת מיקרוסקופ (KESM). תמונה של KESM מוצג עם הרכיבים העיקריים שלה מסומן: (1) במהירות גבוהה קו סריקה המצלמה, (2) המטרה מיקרוסקופ, (3) הרכבה יהלום סכין collimator אור, (4) speטנק cimen (הדמיה טבילה במים), (5) בשלושה צירים דיוק אוויר נושאי הבמה, (6) לבן אור הפנס מיקרוסקופ, (7) משאבת מים (מאחור) להסרת רקמה מחולק, (8) PC שרת לבקרת הבמה רכישת התמונה, (9) בסיס גרניט (10) גשר גרניט. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" /> איור 4. עקרונות הדמיה של KESM. המנהל המבצע של KESM מודגם. המטרה ואת סכין מוחזק במקום, בעוד הדגימה מודבקת על הבמה נע מיצוב (חץ עם קו מוצק) ברזולוציה של 20 ננומטר ומהירות הנסיעה של 1-5, ומקבל והשתפשפה סכין יהלום (5 מ&quot;מ רחב עבור המטרה 10X), יצירת קטע דק זורם על הסכין (חץ עם קו מוצק). קו סריקה הדמיה נעשה ליד קצה מאוד של הסכין. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" /> איור 5. המצלמה KESM בקרות התמקדות אובייקטיבי. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" /> איור 6. הרכבה KESM סכין שולטת. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" /> איור 7. ראשוני התמקדות דרך נמל תצפית. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" /> איור 8. Controller KESM שלב 2 בקשה (צילום מסך). <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" /> איור 9. מעבד KESM מחסנית היישומים (צילום מסך). <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" /> איור 10. היישום MeVisLab (צילום מסך). <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" /><br/&gt; איור 11 KESM המוח אטלס:. ממשק אינטרנט (צילום מסך). <img alt="איור 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" /> איור 12. KESM המוח כולו נתונים הודו דיו. חזותיים נפח ערימות KESM הנתונים מוצגים עבור ערכת נתונים וסקולרית. (א) מקרוב של הנתונים של כלי הדם. רוחב 100 ~ אממ. (BD) שלוש תצוגות סטנדרטיות של המוח כולו עכבר vasculature (subsampled מתוך נתונים ברזולוציה גבוהה). רוחב ~ 10mm. <img alt="איור 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" /> איור 13. המוח כולו KESM עכבר נתונים Golgi. <img alt="איור 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" /> איור 14. KESM Golgi פרטים נתונים. <img alt="איור 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" /> איור 15. KESM המוח כולו נתונים Nissl. (א) תקריב של Nנתונים issl. אממ ~ 300 3. (BD) שלוש תצוגות סטנדרטיות של המוח נתונים שלם עכבר Nissl (subsampled מתוך נתונים ברזולוציה גבוהה). חתך הראו עבור תצוגה ברורה של מבנים פנימיים.

<ol>
	<li>Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+whole+small+animal+brains+with+the+knife-edge+scanning+microscope.">High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).</li><li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices.">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging,+analysis,+and+integration+of+mouse+brain+networks.">Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).</li><li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure:+Neurons+and+vasculatures.">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy:+High-throughput+imaging+and+analysis+of+massive+volumes+of+biological+microstructures.">Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures.</a> High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope.">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM.">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li><li>McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Brain+Tissue+Scanner.">Development of the Brain Tissue Scanner.</a> Technical Report. , (2002).</li><li>Sporns, O., Tononi, G., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+connectome:+A+structural+description+of+the+human+brain.">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li></ol>

טוד האפמן הוא עם 3Scan, חברה מסחרית המייצרת ומשווקת טכנולוגיה KESM (פטנט בארה&quot;ב # 6744572).

KESM מאפשרת סקר submicrometer ברמה של כמויות גדולות של דגימות ביולוגיות (~ 1 ס&quot;מ 3). סוג זה של נפח הוא מספיק כדי להכיל את כל האיברים בעלי חיים קטנים, כמו המוח, הריאות, הלב, הכליות, ועוד תמונות סרוקות מאיברים אלה יכולים לספק מידע כמותי חסר תקדים על הארגון המבני של איברים אלה, ולאפשר מודלים חישוביים של פונקציונליים שונים היבטים של איברים אלה, כולל דינמיקה מעגל רשת, תכונות חשמליות, נוזלים וזרימה הדינמיקה אוויר, ואת הדינמיקה שרירים. הכנת הדגימה פרוטוקול שלאחר ניתוח פרוטוקול מפורט במאמר זה צפויים לעזור קבוצות מחקר מחוץ יש גישה קלה יותר KESM לבין הנתונים המתקבלים. הפרוטוקול מבצע KESM יעזור אלה חוקרים חיצוניים כדי להעריך את היתרונות והמגבלות של שיטת הדמיה ייחודית זו.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy

התקדמות ניכרת תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, שיטות מיקרוסקופיה 3D אפשרו רכישת כמויות גדולות של נתונים neuroanatomical ברזולוציה submicrometer. אחד הכלים הראשון מסוגו, בהפקת המוח כולו בקנה מידה הנתונים הוא מיקרוסקופ כסכין סריקה (KESM) 7, 5, 9, שפותחה ואירוח במעבדה של המחברים. KESM שימש סעיף ו כל דמות העכבר מוחות ברזולוציה submicrometer, חושף את הפרטים המורכבים של רשתות נוירונים (Golgi) 1, 4, 8, רשתות כלי דם (דיו הודו) 1, 4, גוף התא הפצה (Nissl) 3 . השימוש KESM אינו מוגבל העכבר ולא את המוח. יש לנו הדמיה בהצלחה את המוח תמנון 6, ריאות העכבר במוח חולדה. כרגע אנחנו עובדים על כל עוברי דג הזברה. נתונים כאלה יכול מאוד לתרום connectomics מחקר 10; אל microcirculation ומחקר hemodynamic וכן מחקר stereology ידי proviדינג מדויק הקרקע האמת. במאמר זה נתאר את הצינור, כולל הכנת הדגימה (תיקון, צביעה, והטבעה) תצורה KESM וההתקנה, חתך הדמיה עם KESM, עיבוד תמונה, הכנת נתונים, נתונים להדמיה וניתוח. הדגש יהיה על הכנת הדגימה ויזואליזציה / ניתוח של נתונים שהתקבלו KESM. אנו מצפים פרוטוקול מפורט שהוצג במאמר זה כדי לעזור להרחיב את הגישה KESM ולהגדיל את ניצול שלה.

Watch this Scientific Journal Video about Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy at JoVE.com

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

תהליך מלא של הכנת הדגימה המוח הדמיה חתך סדרתי באמצעות מיקרוסקופ כסכין סריקה, עד ראיה וניתוח של נתונים מתואר. טכניקה זו משמשת כיום לרכוש במוח העכבר נתונים, אך הוא החלים על איברים אחרים, מינים אחרים.

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.5K Views.  Texas A&M University. תהליך מלא של הכנת הדגימה המוח הדמיה חתך סדרתי באמצעות מיקרוסקופ כסכין סריקה, עד ראיה וניתוח של נתונים מתואר. טכניקה זו משמשת כיום לרכוש במוח העכבר נתונים, אך הוא החלים על איברים אחרים, מינים אחרים.

Video: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...