وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (# 1R01 - NS54252) ، جبهة الخلاص الوطني (# 0905041 ، 0079874 #) ، وبرنامج التكنولوجيا المتقدمة في تكساس (ATP - # 000512-0146 - 2001 ، # ATP - 000512 - 0261 - 2001) ، تكساس A &amp; M مؤسسة أبحاث ، قسم علوم الكمبيوتر والهندسة في جامعة تكساس A &amp; M ، و3Scan. نود أن نشكر برنار ميسا (مايكرو ستار تكنولوجيز) للتشاور والدعم الفني لأجهزة KESM. وقد تم أجزاء كبيرة من تصميم وتنفيذ KESM بواسطة بروس ماك كورميك ، الذي توفي في عام 2007.

1. تحضير العينة : غولجي كوكس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا البروتوكول تتابع عن كثب بروتوكول Mayerich وآخرون. 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس C57BL/6J هو تخدير عميق باستخدام التخدير isoflurane نشوق ومقطوعة الرأس ثم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة المخ وضعت في حل تثبيت غولجي كوكس (1 كرومات البوتاسيوم ٪ ، ثاني كرومات البوتاسيوم 1 ٪ ، وكلوريد الزئبق 1 ٪ في الماء منزوع الأيونات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويترك الدماغ في حل غولجي كوكس في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة ، لمدة 10 إلى 16 أسبوعا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتشطف في ماء منزوع الأيونات أدمغة بين عشية وضحاها في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير منغمسين في الدماغ تشطف 5 ٪ محلول هيدروكسيد الأمونيوم في الماء منزوع الأيونات لمدة 7 إلى 10 أيام في الظلام في درجة حرارة الغرفة. وكان هذه المرة إعداد مطولة لضمان تسلل الدماغ بأكمله ، بحيث يعجل سوداء كانت لديه فرصة لتشكيل تماما في الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شطف الدماغ مرة أخرى في الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات و t50 ٪ و 70 ٪ في الثلاجة (4 درجات مئوية) ، و 85 ٪ ، 95 ٪ (3 تغييرات) ، و 100 ٪ (4-5 تغييرات) في درجة حرارة الغرفة : المجففة من خلال سلسلة متدرجة من الكحول الإيثيلي الدجاجة. ويترك الدماغ في كل حل لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع الدماغ المجففة في الاسيتون (3-4 التغييرات ، كل ليوم واحد) ، يليه خليط araldite - الأسيتون مع araldite إلى الأسيتون نسبة 1:2 ، 1:1 ، 2:1 ، وأخيرا في araldite 100 ٪ (3 تغييرات ، في كل مرة بين عشية وضحاها) ، في الثلاجة (4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، تم تضمين المعالجة في الدماغ araldite 100 ٪ وتسخينها إلى 60 درجة مئوية لمدة 3 أيام (راجع بروتوكول التضمين في ابوت وسوتيلو 2). إذا هي جزء لا يتجزأ العينات في وايت LR ثم يتم نقل العينات من الحل الأخير الإيثانول بنسبة 100 ٪ خلال ثلاثة تغييرات من حل الابيض LR التي يتم الاحتفاظ بها في كل الثلاجة بين عشية وضحاها ، وهو الإجراء القياسي قبل البلمرة. تتم ثلاثة تغييرات لضمان تسلل الكامل. العينة هو رالدجاجة تحويلها إلى الأبيض LR الطازجة التي يتم بلمرة في حاوية مغلقة عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وهو المبلغ المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لالبلمرة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التين. 1 يظهر الدماغ غولجي كوكس ملطخة مضمن في Araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم هي التي شنت كتلة العينة شفي على المعدن الدائري باستخدام عينة الايبوكسي ، وعلى جانبي كتلة قلص عند الضرورة (انظر الشكل 2). </li></ol> 2. تحضير العينة : نيسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفأر هو الخدر العميق باستخدام الكيتامين وزيلازين (1.7 ملغ الكيتامين / 0.26 ملغ زيلازين بنسبة 20 جرام من وزن الجسم) ثم حقن intraperitoneally perfused transcardially باستخدام 50 مل من درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (7.4 درجة الحموضة) ، يليه 250 مل من الغرفة درجة الحرارة 10 ٪ مخزنة محايدة الفورمالين (7.4 درجة الحموضة). وأخيرا مع 3.0 سم مكعب من الحبر الهند مخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كامل الجسم مع نضح المياه المالحة وتثبيتي ضروري لمسح الدم من القلب والأوعية الدموية والنظام لإصلاح منظمة الشفافية الدولية<html> ssues. نضح مع الحبر الهند أمر ضروري لملء تماما لنظام الأوعية الدموية القلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدماغ الناتجة المجففة ثم من خلال سلسلة من الكحول الإيثيلي متدرج (25 ٪ -100 ٪) وجزءا لا يتجزأ من البلاستيك ثم في araldite بعد بروتوكول 1،8-1،9 في أعلاه. إذا LR الأبيض المتوسط ​​التضمين ثم تبعتها في ذلك البروتوكول و1.10 أعلاه. </li></ol> 4. تحضير العينة : الأنواع عامة وهيئات عامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحالة عامة ، يمكن القيام تثبيت إما مع 10 ٪ محايد مخزنة بارافورمالدهيد الفورمالين أو 4 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أحجام صغيرة للنسيج ، فمن المستحسن نشر بدلا من نضح لتثبيت وتلوين. في حالة الكائنات الحية الصغيرة أو الأجهزة ، يمكن أن يتم تلطيخ أيضا أثناء عملية الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول التضمين هو نفس أعلاه ، بالرغم من أنه يمكن خفض مرات لتسلل حل للأجهزة أو الكائنات الحية التي هي أصغر بكثير من دماغ الفأر كله. </li></ol>jove_title &quot;KESM&gt; 5. الإعداد والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف المضخة ، بدوره على خشبة المسرح ، بدوره على الكاميرا ، بدوره على منار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع السكين وموضوعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت حلقة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس البعد عينة وإنشاء ملف تكوين لتطبيق المرحلة KESM Controller2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المرحلة KESM Controller2 وتهيئة المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض سكين / الهدف ، تشغيل المضخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركز الهدف والكاميرا ، التي تحول مقبض التركيز على تدريب وضبط الحقل البصري للكاميرا وجهة نظر بالنسبة الى حافة السكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على [الذهاب] لبدء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر التين. 3-8. انظر 9 ، 7 للحصول على التفاصيل التقنية. </li></ol> 6. معالجة الصور وإعداد البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ المعالج القابل للتنفيذ KESM المكدس في مجلد البيانات ضمن المجلد ملف التكوين (00000 ، 00001 ، الخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المعالج المكدس KESM لإزالة قطعة أثرية الإضاءة وتطبيع كثافة الخلفية في جميعالصور. أكرر لجميع المجلدات الفرعية البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البلاط متعددة النطاقات من مجموعة البيانات وتحميلها وإعداد الملفات في الدماغ خادم الويب KESM أطلس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر الشكل. 9. </li></ol> 7. بيانات التصور والتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصور باستخدام أطلس الدماغ KESM. انتقل إلى <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> وحدد الأطلس المناسبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنقل كما هو الحال في خرائط جوجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكبير والتصغير كما هو الحال في خرائط جوجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للذهاب الى عمق مختلفة ، وتحديد كيفية العميق لتذهب في كل خطوة من القائمة المنسدلة ، ثم انقر على [+] أو بإحدى هاتين العقوبتين -- لزيادة أو نقصان عمق ض []. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط عدد تراكب باستخدام القائمة المنسدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الفاصل الزمني تراكب باستخدام القائمة المنسدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر الشكل. 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصور MeVisLab به. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق MeVisLab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مشروع جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في ما يلي ، يمكن أن يكون إنشاء وحدات جديدة من قبل تايping في اسم الوحدة النمطية في مربع الأوامر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وحدة نمطية [Compose3Dfrom2DFiles] ، وانتقل إلى المجلد المطلوب. أدخل سلسلة الملف وانقر في [GetFileList]. تأكد من أن الصور التي اخترتها يمكن وضعها في الذاكرة. فوق [Create3D] لإنشاء وحدة التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وحدة نمطية [SetWorldMatrix] ، وتعيين &quot;جدول&quot; تحت عنوان &quot;التحويلات الابتدائية&quot; س ، ص ، ض لحجم فوكسل المناسب (0.6 ، 0.7 ، 1.0 لهدف 0.45NA 10X). الرابط [Compose3Dfrom2DFiles] إلى [SetWorldMatrix]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة مصفوفة والتحويلات تحت عنوان &quot;تكوين مصفوفة&quot; إلى &quot;تجاهل&quot; ، &quot;تجاهل&quot; ، &quot;إلى الأمام&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وحدة نمطية [Arithmetic1] ، وتعيين &quot;الفعل&quot; إلى &quot;عكس (IMG ماكس)&quot;. الرابط [SetWorldMatrix] إلى [Arithmetic1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وحدة نمطية [View3D] وربط [Arithmetic1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في View3D ، في حين يتم الضغط على زر الفأرة الأيمن ، قم بتحريك الماوس لضبط العتبة. يمكنك المحاصيل المناطق ، وتغيير التوجه (الماوس تتحرك في حين ضغط زر الماوس الأيسر) ، والإضاءة تغيير (حجم renderinز أو MIP) ، تشغيل / إيقاف الخلفية ، الخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر الشكل. 10. </li></ol></li></ol> 8. ممثل النتائج : هنا ، نقدم كامل الدماغ البيانات والتفاصيل. التين. 12-15 تظهر كلها في الدماغ الهند الحبر ، غولجي والبيانات نيسل مجموعات 1 و 4 و 3. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" /> الشكل 1. الثابتة ، الملون ، وجزءا لا يتجزأ من مخ الفأر <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" /> الشكل 2. شنت المضمنة عينة مخ ​​الفأر على الحلقة العينة. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" /> الشكل 3 ، والمسح الضوئي حافة السكين مجهر (KESM). وترد صورة للKESM مع مكوناته الرئيسية ملحوظة : (1) سكين الماس عالية السرعة خط تفحص الكاميرا ، (2) الهدف المجهر ، (3) والتجمع ، وميزاء الخفيفة ، (4) جمعية مهندسي البترولcimen دبابات (التصوير غمر المياه) ، (5) ثلاثة محاور الدقة الجوية الحاملة للمرحلة ، (6) منار مجهر الضوء الأبيض ، (7) مضخة المياه (في الظهر) لإزالة الأنسجة مقطوع ، (8) خادم الكمبيوتر لمراقبة المرحلة والحصول على الصور ، (9) قاعدة من الجرانيت ، و (10) جسر الجرانيت. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" /> الشكل 4. مبادئ التصوير من KESM. ويتجلى مبدأ تشغيل KESM. الهدف هو عقد والسكين في مكان ، في حين أن العينات الموضوعة على التحركات مرحلة تحديد المواقع (السهم مع خط الصلبة) في قرار من 20 نانومتر وسرعة سفر 1-5 ، ويحصل على كشط ضد السكين الماس (5 ملم واسعة عن الهدف 10X) ، وتوليد مقطع رقيقة تتدفق على سكين (السهم مع خط الصلبة). ويتم فحص الخط والتصوير القريب جدا من طرف السكين. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" /> الشكل 5. KESM الكاميرا والهدف ضوابط التركيز. <img alt="الشكل 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" /> الشكل 6. KESM التجمع سكين والضوابط. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" /> الرقم 7. الأولية التي تركز من خلال منفذ المراقبة. <img alt="الشكل 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" /> الرقم 8. KESM المراقب تطبيق المرحلة 2 (الصورة). <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" /> الرقم 9. KESM تطبيق المعالج المكدس (الصورة). <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" /> الرقم 10. MeVisLab التطبيق (الصورة). <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" /><br/&gt; الرقم 11 KESM أطلس الدماغ : واجهة ويب (الصورة). <img alt="الرقم 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" /> الرقم 12. KESM الحبر الهند بأكملها في الدماغ البيانات. وتظهر حجم كدسات أميبا KESM البيانات لمجموعة البيانات الأوعية الدموية. (أ) عن قرب من البيانات الأوعية الدموية. عرض ~ 100 ميكرون. (BD) ثلاثة آراء مستوى الأوعية الدموية في الدماغ كله الماوس (subsampled من بيانات عالية الوضوح). ~ 10MM العرض. <img alt="الرقم 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" /> الرقم 13. KESM كامل البيانات غولجي مخ الفأر. <img alt="الرقم 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" /> الرقم 14. KESM غولجي تفاصيل البيانات. <img alt="الرقم 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" /> الرقم 15. KESM كامل البيانات نيسل الدماغ. (أ) عن قرب من Nissl البيانات. ~ 300 ام 3. (BD) ثلاثة آراء القياسية للمجلس بكامل هيئته دماغ الفأر البيانات نيسل (subsampled من بيانات عالية الوضوح). مقطع عرضي لعرض رؤية واضحة للهياكل الداخلية.

<ol>
	<li>Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+whole+small+animal+brains+with+the+knife-edge+scanning+microscope.">High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).</li><li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices.">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging,+analysis,+and+integration+of+mouse+brain+networks.">Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).</li><li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure:+Neurons+and+vasculatures.">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy:+High-throughput+imaging+and+analysis+of+massive+volumes+of+biological+microstructures.">Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures.</a> High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope.">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM.">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li><li>McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Brain+Tissue+Scanner.">Development of the Brain Tissue Scanner.</a> Technical Report. , (2002).</li><li>Sporns, O., Tononi, G., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+connectome:+A+structural+description+of+the+human+brain.">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li></ol>

تود هوفمان هو مع 3Scan ، وهي شركة تجارية التي تقوم بتصنيع وتسويق التكنولوجيا KESM (الولايات المتحدة للبراءات 6744572 #).

وKESM يسمح لمسح submicrometer المستوى من كميات كبيرة من العينات البيولوجية (~ 1 سم 3). اخذت الخ هذا النوع من حجم كاف لعقد كامل الأجهزة الحيوانات الصغيرة ، مثل العقل والرئتين والقلب والكلى ، وصور من هذه الأجهزة يمكن أن توفر معلومات كمية لم يسبق لها مثيل حول التنظيم الهيكلي لهذه الأجهزة ، وتمكن من النمذجة الحاسوبية الفنية المختلفة جوانب من هذه الأجهزة ، بما في ذلك ديناميات الدوائر والشبكة ، والخصائص الكهربائية ، وديناميات السوائل وتدفق الهواء ، وديناميكية العضلات. ومن المتوقع أن بروتوكول إعداد العينات وبروتوكول ما بعد تحليل مفصل في هذه المقالة لمساعدة المجموعات البحثية خارج لسهولة الوصول إلى KESM والبيانات الناتجة عن ذلك. فإن بروتوكول العملية KESM مساعدة هؤلاء الباحثين الخارجيين لتقدير الفوائد والقيود المفروضة على هذه الطريقة تصوير فريدة من نوعها.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy

وقد مكنت الاكتشافات الكبيرة في الإنتاجية العالية ، وارتفاع القرار ، وتقنيات الفحص المجهري 3D اقتناء كميات كبيرة من البيانات في القرار submicrometer تشريحي عصبي. واحد من الصكوك الأولى من نوعها تنتج في الدماغ كله على نطاق البيانات هي مجهر مسح السكين الحافة (KESM) 7 ، 5 ، 9 ، المتقدمة واستضافت في مختبر المؤلفين. وقد استخدمت KESM إلى الباب والعقول كلها في صورة الفأر submicrometer القرار ، وكشف عن التفاصيل المعقدة للشبكات العصبية (غولجي) 1 ، 4 ، 8 ، وشبكات الأوعية الدموية (الهند الحبر) 1 و 4 و الخلية توزيع الجسم (نيسل) 3 . ولا يقتصر استخدام الفأرة لKESM ولا الدماغ. لقد نجحنا في تصوير الدماغ الأخطبوط 6 ، الرئة الماوس ، والدماغ الفئران. نحن نعمل حاليا على كامل أجنة أسماك الزرد. ويمكن مثل هذه البيانات تسهم إسهاما كبيرا في البحوث connectomics 10 ؛ لدوران الأوعية الدقيقة والبحوث الدورة الدموية ، والتجسيم للبحث عن طريق ال Øقرع ملف. الدقيق الأرضية الحقيقة في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف خط الأنابيب ، بما في ذلك إعداد العينات (إصلاح ، وتلطيخ ، وتضمينها) ، KESM التكوين والإعداد ، والتصوير sectioning مع KESM ، ومعالجة الصور ، وإعداد البيانات ، والبيانات والتصور والتحليل. وسوف يكون التركيز على إعداد العينات والتصور / تحليل البيانات التي تم الحصول عليها KESM. نتوقع بروتوكول المفصلة التي قدمت في هذه المقالة للمساعدة في توسيع فرص الحصول على KESM وزيادة الاستفادة منه.

Watch this Scientific Journal Video about Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy at JoVE.com

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

وصفت عملية التحضير الكامل من عينة المخ لتصوير المسلسل sectioning باستخدام مجهر المسح حد السكين ، لتصور وتحليل البيانات. ويجري حاليا استخدام هذه التقنية للحصول على بيانات مخ الفأر ، ولكنه ينطبق على الأجهزة الأخرى ، وأنواع أخرى.

تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.5K Views.  Texas A&M University. وصفت عملية التحضير الكامل من عينة المخ لتصوير المسلسل sectioning باستخدام مجهر المسح حد السكين ، لتصور وتحليل البيانات. ويجري حاليا استخدام هذه التقنية للحصول على بيانات مخ الفأر ، ولكنه ينطبق على الأجهزة الأخرى ، وأنواع أخرى.

Video: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

فيديو معدل الميكروسكوب متحد البؤر المسح الضوئي وMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

الهجين التصوير μCT-FMT وتحليل الصور

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...