עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות, NIH מענק מס / NCRR P41-RR 016292 (עבור ACERT).

1. חומרים כל ממיסים המשמשים בעבודה זו היו בכיתה מגיב. מלכודת ספין, כולל N-טרט-בוטיל-α-phenylnitrone (PBN) ואת התווית ספין תקן 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (טמפו) התקבלו סיגמא שימשו המסופקים. נוגדי חמצון המפעל התקבלו מסחרית של סוונסון, Inc בארה&quot;ב. 2. הכנת עשן סיגריות וניתוח של רדיקלים חופשיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להציג חומרים נוגדי חמצון לתוך המסנן, פיקנוגנול נוגדי חמצון תמצית זרעי ענבים היו מומסים הראשון אתנול 95%, ואילו הליקופן היה מומס אצטון. הכרכים ממס היו שונים בהתאם מסיסות נוגדי חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות נוגדי החמצון של 0.4 מ&quot;ג / פילטר היה בשימוש. הם היו מצופים אז עם 10 מ&quot;ג של פחם פעיל. לשם כך פחם פעיל היה נרגש עבור ~ 12 שעות עם הפתרון נוגד חמצון בתנאים אנאירוביים, מסונן מיובשים תחת ואקום. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדי חמצון הוכנסו מכן לתוך המסנן אצטט קונבנציונלי (ע&quot;א לסנן). לענין זה, מסנן נחתך לשני חלקים. המפעל נוגדי חמצון מצופה הוכנסו בין שתי פיסות המסנן עטוף בפיסת קלטת כדי ליצור מסנן - נוגד חמצון, מסנן כריך (איור 1A). מסנן זה בשילוב צורפה לאחר מכן מוטות סיגריות המכילות טבק. בקרת המסנן נעשה באותה דרך כמו מסנן נוגד חמצון, למעט נוגדי חמצון לא נוספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הסימולציה עישון, סיגריות המחקר היו פרקה והמשיך בסביבת לחות קבועה (20 ° C, לחות יחסית של 60%) באמצעות פתרון NaBr רווי מינימום של 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סימולציה עישון לניתוח שגרתי בוצע בטמפרטורת הסביבה באמצעות מכשיר חד נמל העישון אשר, כפי שמוצג תמונה 1, מורכב aspirator מים או גסט DOA-P104-BN משאבת ואקום / מדחס אוויר (בנטון הארבור, Mich) המחובר על השמנה, ספיןהרכבה דרך צומת-T עם קצה אחד פתוח. נפחא בוצעו על ידי פקיקה את הקצה הפתוח אשר נותרה פתוחה בין שאיפות. זרימת הגז נבדקה על ידי מד זרימת ולהגדיר ב ~ 2.2 SCFH = 17.5 mL / s על ידי התאמת שסתום ממוקם בין המשאבה לבין פורקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיגריות המחקר היו מעושן בתנאים של נפח נשיפה של 35 מ&quot;ל למשך של 2 שניות חוזר כל 60 שניות, בדומה 1. סימולציה עישון לאמידה כמותית של גז שלב רדיקלים חופשיים בוצע בשיתוף עם מערכת ספין השמנה כפי שמוצג באיור. 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרת פחזניות אינטנסיבי (35 mL / נשיפה) נלקחו כל סיגריה. גז שלב רדיקלים חופשיים נאספו על ידי העברת MCS דרך מסנן קיימברידג&#39; לרפד ולאחר מכן הציג את הפתרון ספין השמנה (0.05 מ &#39;PBN ב בנזין, 2.0 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נשיפה האחרון, הפתרון השמנה מבעבע היה וסידרה נפח הראשונית שלה (2.0 מ&quot;ל) עם בנזן זהה. Aliquot הועבר אל ~ 250 מ&quot;מ אורך, 3 מזהה מ&quot;מ זכוכית צינור אטום בקצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון היה deoxygenated השמנה באמצעות הליך הקפאת-pump-ההפשרה. זה היה קפוא תחת חנקן נוזלי, ו - ואקום יושמה. אז זה היה מופשר תחת אווירה ארגון, המאפשר בועות גז שנלכדו לברוח, קפוא שוב. לאחר מחזור זה חזר על עצמו שלוש פעמים, הצינור היה להבה חתום תחת ואקום ומשמש במדידות שקיעת דם נוספת. צעד זה נדרש כי חמצן, אשר מסיסה היטב בנזן, מרחיב קווי שקיעת דם של רדיקלים אורגניים. Deoxygenation משפר באופן דרמטי את יחס האות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> X-Band שקיעת דם ספקטרה נרשמו על ספקטרומטר Bruker EMX בתדר של 9.34 GHz בתנאים סטנדרטיים. ההגדרות ספקטרומטר בשימוש ברוב הניסויים היו: מרכז השדה 3312.5G, סריקת רוחב 80G, אפנון משרעת 0.5g, קבוע הזמן 82 מיקרו שניות, זמן סריקה 40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלכודת adducts ספין הם יציבים יחסית לתנאי הניסוי, אשר במקרים מסוימים required 25 הצטברויות, אשר בדרך כלל לקח ~ 20 דק &#39;. עם זאת, לאחר 12 שעות את עוצמת האותות שקיעת דם בתמיסה בנזין ירד בפקטור של ~ 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את הריכוז של adduct השמנה, הראשונה נגזרת הקשת הראשונית שקיעת דם היה משולב. ספקטרום הבליעה שהתקבל מראה רקע גופיה רחבה, ככל הנראה בשל פיח / זפת המוצרים הכלולים העשן. לאחר ניכוי רקע זה שלישיה הפרידה של adduct השמנה היה משולב עוד פעם אחת (איור 2). </li></ol> 3. נציג תוצאות רוב הרדיקלים החופשיים המיוצרים סיגריה בוערת עשן (שלב גז) הם רגעי ובלתי יציב. על מנת לצפות אלה רדיקלים טכניקה מלכודת ספין הוא מועסק. היא לוכדת גז שלב רדיקלים חופשיים על ידי להפוך אותם adduct ספין שהוא יותר יציב והוא יכול להיות מזוהים על ידי שקיעת דם (תמונה 1). במחקר הנוכחי, הפתרון ספין מלכודת של 0.05M PBN שימש לאיסוף גז עשן שלב רדיקלים חופשיים, שהם תערובת של רדיקלים חמצן ופחמן ממוקדת אשר קשה להפריד בין 15. במקרה שלנו, לעומת זאת, פיצול קבועים נצפתה hyperfine = N 13.7G ו = H 1.95G דומים מאוד לערכים המתאימים עבור לכידת adducts של רדיקלים חופשיים alkoxyl (RO.) 2, מה שמראה כי הם המוצר העיקרי. הראינו כי אותות חלשים reproducibility שקיעת דם נמוך נצפתה במדידות הראשוניות שלנו (איור 2) היו בשל הלחות בזרימת עשן. כדי לפתור בעיה זו, הוספנו חנקן נוזלי (LN2) מלכודת בין מסנן קיימברידג&#39; הפתרון למלכודת הספין. מלכודת 2 LN מוסר מזרימת מים MCS על ידי הקפאה מהירה ללכוד אותו על הקיר הפנימי של צינור הזכוכית. זה השתפר מאוד אותות שקיעת דם ואפשרו תוצאות לשעתקו מאוד (איור 3). כמות הרדיקלים החופשיים לכודים נקבע באמצעותהתייחסות המדגם. לקבלת דוגמיות לשלוט ללא חומרים נוגדי חמצון, ריכוז adduct טיפוסי בנזן מוערך על ידי השוואה של הספקטרום נפרד כפולה עם קשת אינטגרלי כפול ריכוז ידוע של קצב היה 1.24 מיקרומטר (Fig.2). מאז כמות האוויר עבר כל סיגריה בזמן העישון ~ 350 מ&quot;ל, זה נותן אומדן ריכוז רדיקלים חופשיים גז בשלב של MCS של ~ 7.1X10 מ -9, וכן סך של רדיקלים לכודים משלב גז סיגריה שלמה של ~ 1.5X10 15. אומדן הסכום הכולל של הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריה כולה, כולל גז והן בשלב חלקיקים, היה 10 ~ 16 רדיקלים חופשיים 9. רמות שונות של השפעת הדחה של הצמח חומרים נוגדי חמצון על גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן סיגריות הזרם המרכזי נצפו. שיעורי הדחה שלהם הוצגו איור. 4. ליקופן ותמצית זרעי ענבים הראו את השיעורים הגבוהים ביותר תוך נמוךשיעור אה נצפתה פיקנוגנול (Fig.4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים של תכנון סימולציה משופר עישון לאיסוף גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות המיינסטרים (MCS) באמצעות מלכודת ספין. MCS צויר על ידי aspirator מים דרך מסנן CA, אז קיימברידג&#39; מסנן (מסנן צהוב) ועבר דרך מלכודת חנקן נוזלי כדי להסיר H 2 O. הגז בשלב מוצרים ולבסוף הלך ספין מלכודת מבעבע דרך הפתרון למלכודת הספין. נוגדי חמצון הצמח הונח בין שתי פיסות מסננים אצטט קונבנציונאלי (מוגדל במעגל) מצורף סיגריה כדי לחפש רדיקלים חופשיים MCS. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" /> באיור 2. הערכה כמותית של ריכוז ספין השמנה adduct ב בנזן דורש הפחתת אות רקע רחב של Integra firstאני קשת. פיצול hyperfine הפרמטרים adduct ספין השמנה הם = 1.95 G H, N = 13.7G. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" /> באיור 3. כשעברו LN2 מלכודת משמעותי משפר את איכות אותות שקיעת דם מתקבל על ידי לכידה ספין של MCS. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" /> איור 4. השפעת נוגדי חמצון טבעיים על ריכוז של רדיקלים חופשיים MCS. עוצמות אות יחסית הם: שליטה - 100%, פיקנוגנול - 55%, תמצית זרעי ענבים - 12%, ליקופן - 10%.

<ol>
	<li>Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+resonance+and+spin+trap+investigation+of+free+radicals+in+cigarette+smoke:+development+of+a+quantification+procedure.">Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure.</a> Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).</li><li>Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+tobacco+smoke.">Free radicals in tobacco smoke.</a> Nature. 229, 500-500 (1971).</li><li>Church, D. F., Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+toxicological+implications.">Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications.</a> Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).</li><li>Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenging+effects+of+hemoglobin+and+related+heme+containing+compounds+on+nitric+oxide,+reactive+oxidants+and+carcinogenic+volatile+nitrosocompounds+of+cigarette+smoke.+a+new+method+for+protection+against+the+dangerous+cigarette+constituents.">Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents.</a> Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).</li><li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+carcinogens+and+lung+cancer.">Tobacco smoke carcinogens and lung cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).</li><li>Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+implication+in+human+cancer.">Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer.</a> Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).</li><li>Nair, A. K., Brandt, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+smoking+on+health+care+costs.">Effects of smoking on health care costs.</a> Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).</li><li>Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Peroxyradicals+in+Cigarette+Smoke+and+the+Scavenging+Effect+of+Shikonin,+a+Naphthoquinone+Pigment.">Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment.</a> Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).</li><li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+and+the+involvement+of+free+radical+reactions+in+chemical+carcinogenesis.">Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis.</a> Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).</li><li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+radicals+and+the+role+of+free+radicals+in+chemical+carcinogenicity.">Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity.</a> Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).</li><li>Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+of+lycopene+from+tomato+processing+byproducts.">Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts.</a> J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).</li><li>Shopland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+use+and+its+contribution+to+early+cancer+mortality+with+a+special+emphesis+on+cigarette+smoking.">Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking.</a> Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).</li><li>Shrikhandle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wine+products+with+health+benefits.">Wine products with health benefits.</a> Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).</li><li>Valavanidis, A., Haralambous, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+by+electron+paramagnetic+resonance+of+free+radical+species+in+the+mainstream+and+sidestream+smoke+of+cigarettes+with+conventional+acetate+filters+and+'bio-filters'.">A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'.</a> Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+stable+free+radicals+in+mechanisms+of+oxidative+damage,+carcinogenesis+and+synergistic+effects+with+other+respirable+particles.">Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אומדן מהימן של ההשפעה של רדיקלים חופשיים נבלות שונים בעשן הטבק דורש טכניקה לשחזור לגילוי כמותי של רדיקלים חופשיים. 1 בעבר, הוכח כי כמויות קטנות של ספין גבוה יותר ריכוז פתרונות מלכודת קוטבי ממיסים יעילים ביותר השמנה רדיקלים חופשיים מתוך עשן טבק. עשן סיגריות מכיל תמיד אדי מים מן הבעירה של תרכובות אורגניות ואת הלחות שאריות טבק אשר יכול בסופו של הממס השמנה. זו תערובת של מים הפתרון למלכודת הספין PBN מקטין באופן משמעותי את חייו של adducts השמנה ספין את עוצמת האותות שקיעת דם שלהם. הסרת הלחות באמצעות MCS פשוט עובר דרך צינור בצורת U מקורר עם חנקן נוזלי באופן דרמטי לשפר את איכות ספקטרה שקיעת דם בניסויים שלנו, למרות שחלק שבריר של גז שלב הרדיקלים יכול להיות לכוד גם על משטח קפוא. שימוש לאהטכניקה שלו השווינו את היעילות היחסית של שונות הרדיקלי הדחה תרכובות טבעיות הציג לתוך פילטרים של סיגריות. מצאנו כי הליקופן ואת זרעי ענבים לחלץ מיד לאחר שילוב לתוך פילטרים לסיגריות יכולים לחפש עד 90% של רדיקלים חופשיים מ MSC השלב גז. כזו יכולת הדחה מדרג גבוה התרכובות הללו זול טבעי וזמין בין מגיני דיווח היעילה ביותר רדיקלים חופשיים כמו המוגלובין shikonine 8,14. ובכל זאת, מסננים בניסויים שלנו סיגריה עמוסה למד נוגדי חמצון טבעיים איבד חלק ניכר של כושר הדחה שלהם לאחר שבוע של אחסון בטמפרטורת החדר. לפתרון בעיה זו יכולה לגרות היישום העתידי של ליקופן ותמצית זרעי ענבים מסננים סיגריות מסחריות.

a protocol for detecting and scavenging gas-phase free radicals in mainstream cigarette smoke

עישון סיגריות קשור סרטן אנושיים. זה כבר דיווחו כי רוב מקרי המוות מסרטן הריאות נגרמים על ידי עישון סיגריות 5,6,7,12. למרות המלחים טבק ומוצרים נלווים בשלב החלקיקים של עשן הסיגריות הם הגורמים העיקריים של מחלות הקשורות ו מוטגניות מסרטנים, עשן סיגריות מכיל כמויות משמעותיות של רדיקלים חופשיים נחשבים גם כקבוצה חשוב של חומרים מסרטנים 9,10. רדיקלים חופשיים לתקוף מרכיבי התא על ידי מבנה חלבונים, שומנים פוגע רצפי DNA ולהגדיל את הסיכון לפתח סוגים שונים של סרטן. רדיקלים בשאיפה לייצר adducts שתורמים רבות של ההשפעות הבריאותיות השליליות של עישון טבק בריאה 3. מחקרים שנערכו כדי להפחית את הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות כדי להקטין סיכונים של פגיעה הנגרמת מעישון. זה כבר דווח כי המוגלובין heme המכיל תרכובות יכול חלקית לחפש תחמוצת החנקן, תגובתיאוקסידנטים nitrosocompounds נדיפים מסרטנים של 4 עשן סיגריות. &quot;ביו מסנן&quot; כלל פחמן המוגלובין מופעל שימש לחפש רדיקלים חופשיים להסיר עד 90% של רדיקלים חופשיים של עשן סיגריות 14. עם זאת, בשל חוסר יעילות, עלות, זה לא היה ממוסחר בהצלחה. מחקר נוסף הראה יעילות הדחה טובה של shikonin, רכיב של צמחי מרפא סיניים 8. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים פרוטוקול מציגה משותף תמציות נוגדי חמצון טבעיים לתוך מסנן את הסיגריה הדחה בשלב גז רדיקלים חופשיים עשן סיגריות מדידת ההשפעה לחפש על שלב רדיקלים חופשיים גז בעשן הסיגריות המיינסטרים (MCS) באמצעות ספין השמנה אלקטרונים ספין תהודה (שקיעת דם) ספקטרוסקופיה 1,2,14. הראינו יכולת הדחה גבוה של ליקופן ותמצית זרעי ענבים אשר יכול להצביע על יישום עתידם פילטרים של סיגריות. יתרון חשוב של המקצוענים האלהאוכלי נבלות pective היא שהם ניתן לקבל כמויות גדולות של מוצרי לוואי של תעשיית עגבניות או יין בהתאמה 11,13

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke at JoVE.com

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

ספין השמנה ספקטרוסקופיה שקיעת דם שימש ללמוד את ההשפעה של נוגדי החמצון ליקופן צמח, פיקנוגנול ותמצית זרעי ענבים על הדחה גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות.

פרוטוקול לאיתור גז הדחה בשלב רדיקלים חופשיים עשן סיגריות רגילה

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

a-protocol-for-detecting-scavenging-gas-phase-free-radicals

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.2K Views.  CDCF-AOX Lab. ספין השמנה ספקטרוסקופיה שקיעת דם שימש ללמוד את ההשפעה של נוגדי החמצון ליקופן צמח, פיקנוגנול ותמצית זרעי ענבים על הדחה גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות.

Video: A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are encapsulated within the aerogels. However, few reports on encapsulating proteins within sol&#8211;gels that are processed to form aerogels exist. A procedure for encapsulating cytochrome c (cyt. c) in silica (SiO2) sol-gels that are supercritically processed to form bioaerogels with gas-phase activity for nitric oxide (NO) is presented. Cyt. c is added to a mixed silica sol under controlled protein concentration and buffer strength conditions. The sol mixture is then gelled and the liquid filling the gel pores is replaced through a series of solvent exchanges with liquid carbon dioxide. The carbon dioxide is brought to its critical point and vented off to form dry aerogels with cyt. c encapsulated inside. These bioaerogels are characterized with UV-visible spectroscopy and circular dichroism spectroscopy and can be used to detect the presence of gas-phase nitric oxide. The success of this procedure depends on regulating the cyt. c concentration and the buffer concentration and does not require other components such as metal nanoparticles. It may be possible to encapsulate other proteins using a similar approach making this procedure important for potential future bioanalytical device development.

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

This procedure describes how to encapsulate cytochrome c (cyt. c) in silica (SiO2) sol-gels, process these gels to form bioaerogels, and use these bioaerogels to rapidly recognize nitric oxide (NO) through a gas-phase reaction. This type of protocol may aid in the future development of biosensors or other bioanalytical devices.

encapsulating ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; ב סיליקה אירוג&#39;ל Nanoarchitectures ללא מתכת חלקיקים תוך שמירת גז שלב פעילות ביולוגית

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

מיקרו-בקר המופעל התקן לדור של נוזלי תמציות קונבנציונאלי סיגריה סיגריה עשן ואלקטרוניקה תרסיס

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

ניקוי קטליטי של הצמח חמצן תגובתי מינים In Vivo על ידי חלקיקי תחמוצת צריום Anionic

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...