עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי של דלקת מפרקים ומחלות עור השלד והשרירים: 3R01AR054458-02S2.

1. יום 1 1) פלייט תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט hMSC בבקבוק T75 בבית% confluency של 80 לפחות 18-24 שעות לפני תיוג. עיין טבלה מס &#39;1 להוראת עבור כלי חלופי. </li></ol> 2. יום 2 2) להכין פתרון תיוג. הכנה זו תווית אחת (1) T75 בקבוק ב 80% confluency עם ריכוז של 400 מיקרוגרם Fe / ml. עיין טבלה מס &#39;1 להוראת עבור כלי חלופי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פתרון (פתרון 1) על ידי ערבוב 1 מ&quot;ל של סרום ללא מדיה 93.1 μl של ferumoxytol (מניות: 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת הפתרון השני (פתרון 2) על ידי ערבוב 1 מ&quot;ל של סרום ללא מדיה 7 μl של סולפט protamine (מניות: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל second חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כל פתרון לנוח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרונות 1 ו -2 יחד. לערבב בעדינות את הפתרון תיוג חדש. אפשר פתרון לנוח במשך 5 דקות כדי לאפשר USPIO הפרומתחמי סולפט tamine הטופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של סרום ללא מדיה מ&quot;ל 2 מעורבת של SPIO / פתרון סולפט protamine עבור נפח סופי של 7 מ&quot;ל. </li></ol> 3) הכינו תאים תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת בין התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות תאים פעם אחת עם 2-3 מ&quot;ל של טרום חימם Mg / Ca ללא D-PBS או בסרום ללא מדיה לשטוף ממני חלבונים בסרום שיורית או רכיבים אחרים לתקשורת, העלולות לפגום חומר ניגוד ספיגת ויעילות תיוג. לשאוב את הנוזלים ולשטוף. </li></ol> 4) תווית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מ&quot;ל להשלים 7 של תיוג פתרון תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום התאים לתוך אינקובטור (37 ° C / 5% CO 2) ולאפשר לתאים כדי לדגור בפתרון תיוג במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של FCS לפתרון תיוג של תאים כדי להשיג ריכוז בסרום סופי של 10%. סרום הוא הוסיף ליצור מחדש את הסביבה העשירה של התאים אשר מורגלים, ועל מנת לסייע minimizing מוות של תאים העלולה לנבוע שינוי פתאומי חשיפה 24 שעות ביממה לסביבה בסרום חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים כדי לדגור עם פתרון תיוג עבור 20 שעות נוספות. </li></ol> 3. יום 3 5) הכנת תאים שכותרתו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון תיוג מן התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות תאים עם 2-3 מ&quot;ל של טרום חימם Mg / Ca ללא D-PBS. לשאוב את PBS. חשוב להשתמש Mg / Ca ללא PBS כמו מ&quot;ג ו Ca יפגע את היעילות של טריפסין בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין מראש חימם 0.05% אל התאים להטות את הבקבוק קדימה ואחורה על מנת להבטיח את פני השטח של הבקבוק מכוסה בשכבה דקה של טריפסין. המקום התאים באינקובטור (37 ° C / 5% CO 2) ולאפשר התאים לנוח 5-7 דקות או עד התאים מתחילים להתנתק הצלחת. זה עשוי להיות נחוץ כדי לאשר ניתוק תחת מיקרוסקופ. לטפוח בעדינות את צידי הבקבוק במידת הצורך כדי facilitate על פני קרום התא ניתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של טרום חימם התקשורת מלאה הבקבוק על מנת לנטרל את טריפסין. לשטוף בעדינות את הבקבוק על ידי pipetting טריפסין / מדיה / פתרון התא למעלה ולמטה מספר פעמים. אסוף את הפתרון כולו צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה הפתרון הנייד RCF 400 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. Resuspend התאים 5 מ&quot;ל של התקשורת (סרום המכיל סרום או ללא). צנטריפוגה הפתרון הנייד RCF 400 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף תא המתואר בשלב 5.5. בסך הכל, התאים יהיו שטופים שלוש פעמים להסיר סוכן שיורית, בניגוד חופשי בתקשורת על פני השטח של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים בשלב זה להשיג את ספירת התאים המדויק ביותר, כמו תאים יאבדו במהלך הכביסה הקודמת. בצעו בדיקת הכדאיות של תאים. תאים מוכנים כעת לניתוח עתידיים או יישום ניסיוני. MR הדמיה ניתן לבצע עם T1 ו-W<html> T2-w פרמטרים, כי למרות ferumoxytol הוא סוכן T2-W לעומת זאת, ferumoxytol גם מפגין השפעות T1. נציג T2-w פרמטרים MRI כי ניתן להשתמש בתאים תמונה ferumoxytol שכותרתו כוללים: FSE או SE_Multislice רצפים עם TR של 2000-2500 ms ו TE של 60-80 אלפיות. כדי לרכוש תמונה T1-W, להקטין את הערך TE על FSE או רצף SE_Multislice או להשתמש רצף GRE עם TR גבוה TE נמוך. איור 4 מדגים את פוטנציאל היישום vivo הדמיה שכותרתו בתאי גזע. </li></ol> 4. נציג תוצאות: תאים תווית להוכיח השפעה משמעותית לעומת המחשיך או שלילית על T2 משוקלל תמונות MR ואת אפקט הניגוד התבהרות או חיובית על T1-משוקלל תמונות MR (איור 2). אורך MR הדמיה בדיקות כדאיות שבוצעו 5 ימים תיוג הודעה הפגינו שום איתות משמעותי MR ואין השפעה משמעותית על כדאיות בהשוואה לקבוצת הביקורת ללא תווית (מידע לא מוצג). jove_content &quot;&gt; בתאי גזע תווית יכול לאחר מכן להיות מובחן לתוך תאים מסוגים שונים או מוזרק לווריד במשך בחקירה vivo. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig1.jpg" /> באיור 1. קו הזמן סכמטי תיוג בתאי גזע עם nanoparticle תחמוצת ברזל, ferumoxytol. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig2.jpg" /> באיור 2. תמונות של MR sagittal חתכים צינורות thrrough Eppendorf עם תאים גלולה התא. א) שולטת ללא תווית. ב) תאים תווית הוכחת T2 משמעותי או השפעה שלילית חומר ניגוד על FSE T2 משוקלל או SE_Multislice הדמיה סוכן T1 או חיובית לעומת השפעה על רצף GRE-T1 משוקלל. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig3.jpg" /> באיור 3. חתכים sagittal של צינורות Eppendorf עם תאים פל תאמאפשר. קטנה כמו 10,000 תאים שכותרתו ferumoxytol ניתן לאתר באמצעות T2-w MR הדמיה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig4.jpg" /> איור 4. להדמיה של MR ferumoxytol שכותרתו בתאי גזע שהוחדר לתוך החדרים מוחין Murine. א) ציר הסיבוב, MR דמותו של ברין Murine עם זריקה לא של USPIO שכותרתו בתאי גזע. ב) ציר הסיבוב, C) העטרה, ו-D) sagittal תמונות MR המתארת ​​את אפקט T2, בניגוד שלילית של USPIO שכותרתו בתאי גזע (חצים לבנים) מוזרק במוח Murine. <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3482/3482table1.jpg" /> 1. טבלת כמות adaptions תיוג התאים כלי חלופי.

<ol>
	<li>Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+induced+pluripotent+and+embryonic+stem+cells:+fraternal+or+identical+twins?.">Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins?.</a> Mol Ther. 19, 635-638 (2011).</li><li>Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+cell+tracking:+clinical+studies.">In vivo MRI cell tracking: clinical studies.</a> AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).</li><li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+Iron+Oxide+Nanoparticles+for+Non-Invasive+in+vivo+Tracking+with+MR+Imaging.">Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging.</a> J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).</li><li>Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MR+imaging+of+magnetically+labeled+human+embryonic+stem+cells.">In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells.</a> Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).</li><li>Jung, C. W., Jacobs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+properties+of+superparamagnetic+iron+oxide+MR+contrast+agents:+ferumoxides,+ferumoxtran,+ferumoxsil.">Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil.</a> Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).</li><li>Coyne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferumoxytol+for+treatment+of+iron+deficiency+anemia+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease.</a> Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).</li><li>Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+reporter+gene+and+iron+particle+labeling+for+tracking+fate+of+human+embryonic+stem+cells+and+differentiated+endothelial+cells+in+living+subjects.">Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects.</a> Stem Cells. 26, 864-873 (2008).</li><li>Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+human+monocytes+to+phagocytose+approved+iron+oxide+MR+contrast+agents+in+vitro.">Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro.</a> Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).</li><li>Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+signal+characteristics+of+viable+and+apoptotic+human+mesenchymal+stem+cells+in+matrix-associated+stem+cell+implants+for+treatment+of+osteoarthritis.">MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis.</a> Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).</li><li>Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+mesenchymal+stem+cells+in+myocardial+infarction.">In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction.</a> Circulation. 107, 2290-2293 (2003).</li><li>Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+particles+for+noninvasive+monitoring+of+bone+marrow+stromal+cell+engraftment+into,+and+isolation+of+viable+engrafted+donor+cells+from,+the+heart.">Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart.</a> Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).</li><li>Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+ferucarbotran+on+the+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells.">The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).</li><li>Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI.">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li><li>Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+Ferumoxides+Labeled+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Cartilage+Defects.">Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects.</a> J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).</li><li>Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transfection+agents+in+forming+complexes+with+ferumoxides,+cell+labeling+efficiency,+and+cellular+viability.">Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability.</a> Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).</li><li>Babic, M., Horak, D., Trchova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-modified+iron+oxide+nanoparticles+for+stem+cell+labeling.">Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling.</a> Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).</li><li>Golovko, D. M., T, H. e. n. n. i. n. g., Bauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+stem+cell+labeling+with+ferucarbotran+and+protamine.">Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine.</a> Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).</li><li>Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+report:+Ferumoxytol+for+intravenous+iron+therapy+in+adult+patients+with+chronic+kidney+disease.">FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease.</a> Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).</li></ol>

כל התורמים ללמוד את ההצעה הזו לא גילויים.

שיפור היעילות של engraftments תא גזע הוא קריטי לקידום רפואה רגנרטיבית. טכניקה לא פולשנית להדמיה עבור בתאי גזע in vivo משפר באופן משמעותי את יכולתנו להבין את המנגנונים להוביל לתוצאות engraftment מוצלח. תיוג להדמיה מגנטית MR, כגון ההליך שהראנו, מאפשר לעקוב אחר vivo בתאי גזע עם ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> D-גלוקוז גבוהה מ </td><td> סיגמא </td><td> D5648 </td><td> או בסיס בינוני אחרים לקו הרצוי בתאי גזע כדי לשמש </td></tr><tr><td> D-PBS (Ca + +, Mg + + חינם) </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA 0.05% </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-120 </td><td></td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Ferumoxytol (Feraheme) </td><td> AMAG </td><td> 59338-0775-01 </td><td></td></tr><tr><td> Protamine סולפט </td><td> APP פארם. </td><td> 22930 </td><td></td></tr>
</tbody>
</table>

labeling stem cells with ferumoxytol, an fda-approved iron oxide nanoparticle

תא גזע טיפולים מבוססי להציע פוטנציאל משמעותי בתחום של רפואה רגנרטיבית. עם זאת, הרבה נשאר להיות מובן לגבי vivo ב קינטיקה של התאים המושתלים. שיטה לא פולשנית כדי לפקח שוב ושוב בתאי גזע המושתלים in vivo תאפשר לחוקרים ישירות לצג של השתלות מוח עצם ולזהות התוצאות engraftment להצליח או להיכשל. מגוון רחב של בתאי גזע ממשיך להיחקר עבור יישומים רבים מספור. פרוטוקול זה מתמקד 3 אוכלוסיות תאים שונות גזע: כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) תאים, אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) ו המושרה גזע pluripotent (שב&quot;ס) תאים. HEK 293 תאים שמקורם בתאי כליה עובריים אנושיים הגדלים עם תרבות ה-DNA טעון adenovirus 5. תאים אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר כי הם בתרבית בקלות, לגדול במהירות והם transfected בקלות. hMSCs נמצאים במח מבוגר. תאים אלה can להיות משוכפל כמו תאים שלא עברו התמיינות, תוך שמירה על multipotency או פוטנציאל להתמיין למספר מצומצם של גורל התא. hMSCs יכול לבדל את שושלות של רקמות mesenchymal, כולל osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, גידים, שרירים, stroma מוח. תאים iPS הם reprogrammed גנטית תאים בוגרים ששונו לבטא גנים וגורמים דומים המאפיינים המגדירים של בתאי גזע עובריים. תאים אלה הם משמעות pluripotent יש להם את היכולת להתמיין לכל שושלות תאים 1. שני hMSCs ותאי iPS הוכיחו יכולת ההתחדשות רקמות ב-vivo. תהודה מגנטית (MR) הדמיה יחד עם שימוש של תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIO) תוויות nanoparticle תא הוכיחו יעילות של מעקב vivo לתאי גזע בשל החלטה אנטומי ליד מיקרוסקופית, דם כבר מחצית החיים המאפשר הדמיה האורך ואת גבוה sensitivity לגילוי תאים הניתנים על ידי MR הדמיה של SPIO חלקיקים 2-4. בנוסף, MR הדמיה עם שימוש של SPIOs הוא לתרגום קלינית. SPIOs מורכבים הליבה תחמוצת ברזל עם מעיל dextran, carboxydextran או עמילן משטח המשמש להכיל את ליבת ברזל bioreactive מרכיבים פלזמה. סוכנים אלה יוצרים מקומיים inhomogeneities השדה המגנטי להוביל אות ירד ב T2 משוקלל תמונות MR 5. למרבה הצער, SPIOs הם כבר לא מיוצרים. הדור השני, ultrasmall SPIOs (USPIO), לעומת זאת, מציעים חלופה. Ferumoxytol (FerahemeTM) הוא אחד USPIO מורכבת הליבה שאינו stoichiometric מגנטיט מוקף מעיל carboxymethylether polyglucose סורביטול. גודל colloidal, חלקיק של ferumoxytol הוא 17-30 ננומטר כפי שנקבע על ידי פיזור האור. משקל מולקולרי הוא 750 kDa, ואת relaxivity קבוע בשדה 2T-MRI הוא 58.609 מ&quot;מ 1 sec-1 כוח 4. Ferumoxytol לאחרונה ה-FDAשל תוספת ברזל לטיפול מחסור בברזל אצל מטופלים עם אי ספיקת כליות 6. בקבוצה שלנו יש להחיל את סוכן להשתמש &quot;את התווית&quot; תיוג עבור יישומים סלולריים. הטכניקה שלנו מוכיח תיוג יעיל בתאי גזע עם ferumoxytol שמוביל משמעותית תופעות MR האות של תאים הנקרא על תמונות MR. טכניקה זו ניתן להחיל לניטור בלתי פולשני של טיפולים בתאי גזע במסגרות טרום קליניים וקליניים.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle at JoVE.com

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

אנו מתארים טכניקה תיוג ומעקב בתאי גזע עם ה-FDA, תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). זו טכניקת דימות הסלולר אשר מנצל מגנטית (MR) תהודה להדמיה, הוא נגיש לניטור ארוך טווח האבחנה של להצליח או להיכשל engraftments תא גזע לחולים.

תיוג בתאי גזע עם Ferumoxytol, ה-FDA אוקסיד Nanoparticle ברזל

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo ...

labeling-stem-cells-with-ferumoxytol-an-fda-approved-iron-oxide

Research

JoVE Journal

Medicine

20.7K Views.  Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS). אנו מתארים טכניקה תיוג ומעקב בתאי גזע עם ה-FDA, תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). זו טכניקת דימות הסלולר אשר מנצל מגנטית (MR) תהודה להדמיה, הוא נגיש לניטור ארוך טווח האבחנה של להצליח או להיכשל engraftments תא גזע לחולים.

Video: Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Continuous Manual Exchange Transfusion for Patients with Sickle Cell Disease: An Efficient Method to Avoid Iron Overload

Children with sickle cell anemia (SCA) may be at risk of cerebral vasculopathy and strokes, which can be prevented by chronic transfusion programs. Repeated transfusions of packed red blood cells (PRBCs) is currently the simplest and most used technique for chronic transfusion programs. However, iron overload is one of the major side effects of this therapy. More developed methods exist, notably the apheresis of RBC (erythrapheresis), which is currently the safest and most efficient method. However, it is costly, complicated, and cannot be implemented everywhere, nor is it suitable for all patients. Manual exchange transfusions combine one or more manual phlebotomies with a PRBC transfusion.
At the Reference Center of Sickle Cell Disease, we set up a continuous method of manual exchange transfusion that is feasible for all hospital settings, demands no specific equipment, and is widely applicable. In terms of HbS decrease, stroke prevention, and iron overload prevention, this method showed comparable efficiency to erythrapheresis. In cases where erythrapheresis is not available, this method can be a good alternative for patients and care centers.

We have outlined a method of continuous manual exchange transfusion for the treatment of sickle cell disease in patients. This safe protocol was designed to effectively limit iron overload in patients in need of chronic transfusions and can be used extensively without any special equipment.

עירוי Exchange ידני רציף עבור חולים עם אנמיה חרמשית: שיטה יעילה כדי למנוע עומס ברזל

Children with sickle cell anemia (SCA) may be at risk of cerebral vasculopathy and strokes, which can be prevented by chronic transfusion programs. ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was synthesized to enhance imaging sensitivity for extrapulmonary tuberculosis (ETB). An SPIO nanoprobe was synthesized and conjugated with MtbsAb. The purified SPIO-MtbsAb nanoprobe was characterized using TEM and NMR. To determine the targeting ability of the probe, SPIO-MtbsAb nanoprobes were incubated with Mtb for in vitro imaging assays and injected into Mtb-inoculated mice for in vivo investigation with magnetic resonance (MR). The contrast enhancement reduction on magnetic resonance imaging (MRI) of Mtb and THP1 cells showed proportional to the SPIO-MtbsAb nanoprobe concentration. After 30 min of intravenous SPIO-MtbsAb nanoprobe injection into Mtb-infected mice, the signal intensity of the granulomatous site was enhanced by 14-fold in the T2-weighted MR images compared with that in mice receiving PBS injection. The MtbsAb nanoprobes can be used as a novel modality for ETB detection.

To improve serological diagnostic tests for Mycobacterium tuberculosis antigens, we developed superparamagnetic iron oxide nanoprobes to detect extrapulmonary tuberculosis.

סינתזה, אפיון, ויישום של Nanoprobes תחמוצת ברזל Superמגנטית לאיתור שחפת הריאות חוץ

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה Polyethyleneimine כרכב למסירה של RNA מפריעות קטן כדי מקרופאגים במבחנה , In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical hurdles such as invasive cell delivery and tracking with low transplantation efficiency remain challenges in translational stem-based therapy. This article describes an emerging technique for stem cell labeling and tracking based on the labeling of the mesenchymal stem cells (MSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO)&#160;nanoparticles, as well as intranasal delivery of the labeled MSCs. These nanoparticles are fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded and safe to label the MSCs, which are subsequently delivered to the brains of TBI-induced mice by the intranasal route. They are then tracked non-invasively in vivo by real-time magnetic resonance imaging (MRI). Important advantages of this technique that combines SPIO for cell labeling and intranasal delivery include (1) non-invasive, in vivo MSC tracking after delivery for long tracking periods, (2) the possibility of multiple dosing regimens due to the non-invasive route of MSC delivery, and (3) possible applications to humans, owing to the safety of SPIO, non-invasive nature of the cell-tracking method by MRI, and route of administration.

Presented here is a protocol for non-invasive mesenchymal stem cell (MSC) delivery and tracking in a mouse model of traumatic brain injury. Superparamagnetic iron oxide&#160;nanoparticles are employed as a magnetic resonance imaging (MRI) probe for MSC labeling and non-invasive in vivo tracking following intranasal delivery using real-time MRI.

מעקב על תחמוצת ברזל פאראמגנטית-מתויג תאי גזע Mesenchymal באמצעות ה-MRI לאחר Intranasal משלוח ב מודל טראומטי פציעה במוח

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis

Kidney stones are becoming more prevalent worldwide in adults and children. The most common type of kidney stone is comprised of calcium oxalate (CaOx) crystals. Crystalluria occurs when urine becomes supersaturated with minerals (e.g., calcium, oxalate, phosphate) and precedes kidney stone formation. Standard methods to assess crystalluria in stone formers include microscopy, filtration, and centrifugation. However, these methods primarily detect microcrystals and not nanocrystals. Nanocrystals have been suggested to be more harmful to kidney epithelial cells than microcrystals in vitro. Here, we describe the ability of Nanoparticle Tracking analysis (NTA) to detect human urinary nanocrystals. Healthy adults were fed a controlled oxalate diet prior to drinking an oxalate load to stimulate urinary nanocrystals. Urine was collected for 24 hours before and after the oxalate load. Samples were processed and washed with ethanol to purify samples. Urinary nanocrystals were stained with the calcium binding fluorophore, Fluo-4 AM. After staining, the size and count of nanocrystals were determined using NTA. The findings from this study show NTA can efficiently detect nanocrystalluria in healthy adults. These findings suggest NTA could be a valuable early detection method of nanocrystalluria in patients with kidney stone disease.

The objective of this study was to determine whether nanoparticle tracking analysis (NTA) could detect and quantify urinary calcium containing nanocrystals from healthy adults. The findings from the current study suggest NTA could be a potential tool to estimate urinary nanocrystals during kidney stone disease.

הערכת Nanocrystals בדרכי השתן בבני אדם באמצעות סידן פלואורופור תיוג וניתוח מעקב חלקיקים

Kidney stones are becoming more prevalent worldwide in adults and children. The most common type of kidney stone is comprised of calcium oxalate (CaOx) ...

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...