3R01AR054458 - 02S2：この作品は、関節炎、筋骨格系の国立研究所と皮膚疾患からの助成金によって支えられて。

1。日1 1）細胞をプレート<ol><li>少なくとも18-24時間前にラベリング〜80％のコンフルエントでT75フラスコでプレートのhMSCを。代替船のための命令については、表1を参照してください。 </li></ol> 2。日2 2）標識溶液を準備します。この準備は、400μgの鉄/ mlの濃度で80％コンフルエントに一つ（1）T75フラスコにラベルを付けます。代替船のための命令については、表1を参照してください。 <ol><li> 15 mlコニカルチューブに：無血清培地1ml及びferumoxytolの93.1μL（30 mg / mlストック）を混合して溶液（溶液1）を作成します。 </li><li>第二15 mlコニカルチューブに：無血清培地1ml及び硫酸プロタミンの7μlの（10 mg / mlストック）を混合することにより、第二の溶液（溶液2）を作成します。 </li><li>各ソリューションは、5分間休憩することができます。 </li><li>一緒に解決策1と2を追加。ゆっくりと新しい標識溶液を混ぜる。ソリューションは、USPIO - PROを許可するために5分間休息することができますtamine硫酸複合体が形成する。 </li><li> SPIO / 7 mlの最終ボリュームのプロタミン硫酸塩溶液との混合2mlに無血清培地5 mlを加える。 </li></ol> 3）標識のための細胞を準備する<ol><li>細胞から培地を吸引除去する。 </li><li>静かに造影剤の取り込みと標識効率を損なう可能性の残余血清タンパク質およびまたはその他のメディアコンポーネントを洗うために予め温めておいたのMg / CaのフリーD - PBSまたは無血清培地の2〜3 mlの細胞を1回洗浄する。リンス液を吸引除去する。 </li></ol> 4）ラベルの細胞<ol><li>細胞へのソリューションをラベリングの完全な7ミリリットルを追加。 </li><li>場所は、インキュベーターにセル（37℃/ 5％CO 2）と細胞は4時間のラベリング溶液中でインキュベートすることができます。 </li><li> 10％の最終的な血清濃度を達成するために細胞のラベリングソリューションにFCS 700μlを添加する。血清は、細胞が慣れているから豊かな環境を再確立するために、そしてマイルを支援するために追加されます。無血清環境に24時間曝露に急激な変化から生じる可能性が細胞死をnimizing。 </li><li>細胞はさらに20時​​間のラベリングソリューションをインキュベートすることができます。 </li></ol> 3。日3 5）標識細胞を準備します。 <ol><li>細胞からの標識溶液を吸引除去する。 </li><li>静かに予め温めておいたのMg / CaのフリーD - PBSの2-3 mlの細胞をすすいでください。 PBSを吸引除去する。それは、MgおよびCaは、次の手順でトリプシンの効率が低下する傾向があるとしてMg / CaのフリーPBSを使用することが重要です。 </li><li>細胞に予め温めておいた0.05％トリプシン液2 mlを追加し、フラスコの表面全体を確実にするために前後にフラスコを傾けはトリプシンの薄層で覆われている。インキュベーター（37℃/ 5％CO 2）内のセルを配置し、細胞がプレートからデタッチし始めるまで細胞が5-7分間、または休息することができます。それは、顕微鏡下で剥離を確認する必要があるかもしれません。 FAに必要に応じてゆっくりとフラスコの側面をタップ細胞表面の剥離をcilitate。 </li><li>トリプシンを中和するためにフラスコに予め温めておいた完全培地4mlを追加します。ゆっくりと上下に数回をトリプシン/メディア/電池ソリューションをピペッティングすることによりフラスコを洗う。 15 mlコニカルチューブ中で、ソリューション全体を収集する。 5分間で400 RCFにおける細胞溶液を遠心してください。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く吸引除去する。メディア5mlの（を含む血清または無血清）で細胞を再懸濁します。 5分間で400 RCFにおける細胞溶液を遠心してください。 </li><li>ステップ5.5で説明したセルの洗浄を繰り返します。合計では、細胞を培地にし、細胞の表面上に残留、無料の造影剤を除去するために3回リンスする。 </li><li>細胞は、前洗浄中に失われるので、最も正確な細胞数を達成するために、この時点で細胞を数える。細胞の生存率のテストを実行します。セルは、その後の分析とや実験的なアプリケーションのための準備が整いました。 MRイメージングは​​、T1 - wで実行することができますし、<html> T2 - wのパラメータは、ferumoxytolはT2 - W造影剤であるがため、ferumoxytolはまた、T1効果を発揮する。画像ferumoxytol標識された細胞に使用できる代表的なT2 - W MRIパラメータが含まれています：FSEまたは2000から2500ミリ秒60〜80ミリ秒のTEのTRとSE_Multisliceシーケンスを。 T1 - Wの画像を取得するには、FSEまたはSE_MultisliceシーケンスのTEの値を下げるか、または高いTRと低TEでのGREシーケンスを使用してください。図4は、標識幹細胞イメージングのためのin vivoでのアプリケーションの可能性を示しています。 </li></ol> 4。代表的な結果： 標識された細胞は、T2強調画像で暗くなる重要なまたは負コントラストの効果とT1強調MR画像（図2）上で明るくまたは正のコントラスト効果を示しています。縦MRイメージングと実行可能性のテストは5日間実行されるポストラベリングは、有意なMR信号と未標識コントロール（データは示さず）に比べて生存率に有意な影響は示されなかった。 jove_content&quot;&gt;標識幹細胞は、その後、種々の細胞型に分化させるまたは静脈内in vivoでの調査でのために注入することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig1.jpg" /> 図1酸化鉄ナノ粒子、ferumoxytolで幹細胞を標識するための回路図のタイムライン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig2.jpg" /> 図2。細胞ペレット中の細胞と矢状断面thrroughエッペンドルフチューブのMR画像。 A）非標識のコントロールが。 B）標識された細胞は、T2強調FSEまたはSE_MultisliceイメージングとT1強調GREシーケンスのT1または正の造影剤の効果に重大なT2または負の造影剤の効果を発揮。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig3.jpg" /> 図3。細胞のPELの細胞とのエッペンドルフチューブの矢状断面ことができます。わずか1万人のferumoxytol標識された細胞は、T2 - W MRイメージングを介して検出することができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig4.jpg" /> 図4。ネズミの脳室に注入ferumoxytol標識幹細胞のMRの可視化。 A）軸、USPIO標識幹細胞の注入なしでマウスバリンのMR画像。 B）冠状軸、C）、およびD）矢状MR画像は、マウス脳内に注入されたUSPIOで標識された幹細胞（白矢印）のT2、否定的なコントラストの効果を描いた。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3482/3482table1.jpg" /> 別の容器に細胞を標識する表1。数量adaptions。

<ol>
	<li>Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+induced+pluripotent+and+embryonic+stem+cells:+fraternal+or+identical+twins?.">Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins?.</a> Mol Ther. 19, 635-638 (2011).</li><li>Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+cell+tracking:+clinical+studies.">In vivo MRI cell tracking: clinical studies.</a> AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).</li><li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+Iron+Oxide+Nanoparticles+for+Non-Invasive+in+vivo+Tracking+with+MR+Imaging.">Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging.</a> J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).</li><li>Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MR+imaging+of+magnetically+labeled+human+embryonic+stem+cells.">In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells.</a> Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).</li><li>Jung, C. W., Jacobs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+properties+of+superparamagnetic+iron+oxide+MR+contrast+agents:+ferumoxides,+ferumoxtran,+ferumoxsil.">Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil.</a> Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).</li><li>Coyne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferumoxytol+for+treatment+of+iron+deficiency+anemia+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease.</a> Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).</li><li>Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+reporter+gene+and+iron+particle+labeling+for+tracking+fate+of+human+embryonic+stem+cells+and+differentiated+endothelial+cells+in+living+subjects.">Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects.</a> Stem Cells. 26, 864-873 (2008).</li><li>Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+human+monocytes+to+phagocytose+approved+iron+oxide+MR+contrast+agents+in+vitro.">Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro.</a> Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).</li><li>Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+signal+characteristics+of+viable+and+apoptotic+human+mesenchymal+stem+cells+in+matrix-associated+stem+cell+implants+for+treatment+of+osteoarthritis.">MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis.</a> Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).</li><li>Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+mesenchymal+stem+cells+in+myocardial+infarction.">In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction.</a> Circulation. 107, 2290-2293 (2003).</li><li>Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+particles+for+noninvasive+monitoring+of+bone+marrow+stromal+cell+engraftment+into,+and+isolation+of+viable+engrafted+donor+cells+from,+the+heart.">Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart.</a> Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).</li><li>Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+ferucarbotran+on+the+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells.">The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).</li><li>Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI.">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li><li>Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+Ferumoxides+Labeled+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Cartilage+Defects.">Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects.</a> J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).</li><li>Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transfection+agents+in+forming+complexes+with+ferumoxides,+cell+labeling+efficiency,+and+cellular+viability.">Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability.</a> Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).</li><li>Babic, M., Horak, D., Trchova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-modified+iron+oxide+nanoparticles+for+stem+cell+labeling.">Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling.</a> Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).</li><li>Golovko, D. M., T, H. e. n. n. i. n. g., Bauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+stem+cell+labeling+with+ferucarbotran+and+protamine.">Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine.</a> Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).</li><li>Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+report:+Ferumoxytol+for+intravenous+iron+therapy+in+adult+patients+with+chronic+kidney+disease.">FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease.</a> Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).</li></ol>

この研究への全貢献者には開示を提供していません。

幹細胞のengraftmentsの有効性を改善することは再生医療の進歩にとって重要です。 in vivoで幹細胞の非侵襲可視化技術は大幅に生着の成功の成果につながるメカニズムを理解する当社の能力を高める。このような我々が実証された手順としてMRの可視化のための磁気標識は、MRイメージングと幹細胞の in vivo追跡にできます。磁気標識された幹細胞は、以前に標的組織に移植?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> D - MEM高グルコース</td><td>シグマ</td><td> D5648 </td><td>使用されるべき所望の幹細胞株、あるいは他の基礎培地</td></tr><tr><td> D - PBS（Ca + +の 、Mg + +のフリー） </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA 0.05パーセント</td><td>インビトロジェン</td><td> 25300-120 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Ferumoxytol （Feraheme） </td><td> AMAG </td><td> 59338-0775-​​01 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸プロタミン</td><td> APP薬学。 </td><td> 22930 </td><td></td></tr>
</tbody>
</table>

labeling stem cells with ferumoxytol, an fda-approved iron oxide nanoparticle

幹細胞ベースの治療は再生医療の分野のための大きな潜在的可能性を提供します。しかし、多くの移植細胞の生体内動態に関する理解されていない。繰り返しin vivoで移植された幹細胞を監視する非侵襲的方法は、研究者が直接幹細胞移植を監視し、成功または失敗した移植の成果を識別できるようになります。 幹細胞の広い範囲は、無数のアプリケーションのために検討され続けている。ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞、ヒト間葉系幹細胞（hMSCの）と人工多能性幹（iPS）細胞：このプロトコルは、3種類の幹細胞集団に焦点を当てています。 HEK 293細胞は、剪断されたアデノウイルス5 DNAとの文化の中で増殖したヒト胚性腎細胞から派生しています。それらが容易に培養されているため、これらの細胞が広く研究に使用されている、急速に増大し、容易にトランスフェクトされています。 hMSCsは、成人の骨髄に見出される。これらの細胞は約多能または細胞の運命の限られた数に分化する能力を維持しながら、n個の未分化細胞として複製される。 hMSCsは、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨、腱、筋肉、及び骨髄間質を含む間葉系組織、の系統に分化することができる。 iPS細胞は、遺伝的遺伝子と胚性幹細胞の定義するプロパティと同様の因子を発現するように変更されている成人の細胞を再プログラムしている。これらの細胞は、彼らがすべての細胞系譜1に分化する能力を持つ多能性の意味です。 hMSCsとiPS細胞の両方は、生体内で組織再生能力を実証している。 一緒に超常磁性酸化鉄（SPIO）ナノ粒子の細胞のラベルの使用による磁気共鳴（MR）イメージングが近くに微細な解剖学的に解決し、幹細胞の生体内追跡のために効果的な証明されている、それより長い血中半減期は、長手方向のイメージングおよび許可する高sensitivitSPIOのMRイメージングで提供される細胞の検出のためのyは2-4ナノ粒子。さらに、SPIOsの使用とMRイメージングは​​臨床的に変換可能です。 SPIOsはデキストラン、carboxydextranまたは血漿成分からbioreactive鉄のコアを含むように機能する澱粉の表面コートと酸化鉄のコアで構成されています。これらのエージェントは、T2強調MR画像5上の減少信号につながる局所磁場の不均一性を作成します。残念ながら、SPIOsはもはや製造されています。第二世代、超小型SPIOs（USPIO）が、しかし、実行可能な代案を提供します。 Ferumoxytol（FerahemeTM）はポリグルコース、ソルビトールcarboxymethyletherコートに囲まれた非化学量論的マグネタイトのコアからなる1 USPIOです。光散乱によって決定されるferumoxytolのコロイド、粒子サイズは17〜30 nmである。分子量は750 kDaのであり、そして2T MRI分野で一定の緩和度は58.609 MM - 1秒-1強度4です。 Ferumoxytolは最近FDA -承認された腎不全6患者における鉄欠乏の治療のためのsは、鉄のサプリメント。当社グループは、細胞標識のアプリケーションのための&quot;オフラベル&quot;使用されてこのエージェントを適用しています。私たちの技術は、MR画像上で標識された細胞の重要なMR信号の効果につながるferumoxytol持つ幹細胞の効率的なラベリングを示しています。この手法は、前臨床および臨床設定における幹細胞療法の非侵襲的なモニタリングに適用されることがあります。

Watch this Scientific Journal Video about Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle at JoVE.com

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo ...

labeling-stem-cells-with-ferumoxytol-an-fda-approved-iron-oxide

Research

JoVE Journal

Medicine

20.7K ビュー.  Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS). 我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。