המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Peiman Hemmati (המחלקה לרפואה, אוניברסיטת וויסקונסין) עבור בנדיבות מתן MSCs H1, ואת ד&quot;ר טים האקר, ד&quot;ר Gouqing שיר גב &#39;ג&#39;יל קוך של אוניברסיטת ויסקונסין לב וכלי דם פיזיולוגיה Core Facility לביצוע ניתוחים העכבר. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מלגת מחקר לתארים מתקדמים על בריאן פרימן NIH R21 HL089679.

1. תא התורם transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mesenchymal קציר בתאי גזע (MSCs, שמקורם בתאי גזע עובריים H1 נתרם באדיבות על ידי ד&quot;ר Peiman Hematti; לחילופין, כל סוג תא של כל מיני שיערו הפתיל in vivo יכול להיות מועסק), כאשר 70-80% ומחוברות עם 1X טריפסין (Mediatech, Manassas VA) במשך 5 דקות. להשבית טריפסין עם המדיום α-ממ מלא (ללא אנטיביוטיקה, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ&quot;ל של 1X PBS ו לספור תאים באמצעות hemacytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1.5 x 10 6 תאים צינור 1.5 צנטריפוגות מ&quot;ל. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 300 μL של R חוצץ (מערכת נאון transfection, Invitrogen) ו 6 מיקרוגרם (2 מיקרוגרם / 5.0 x 10 5 תאים) של p231 pCMVe-betaAc-STOP לוק (Addgene, Cambridge, MA). מקום 3 מ&quot;ל של הצפת E (Invitrעוגן) ליציאת electroporation עגינה לכל פרוטוקול של היצרן (מערכת transfection נאון, Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התא הפלסמיד פתרון טיפ 100 Neon μL pipet ו electroporate עם משך פעימה של 20 אלפיות ו גודל של 1500 וולט. המקום electroporated תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל מכיל 9.7 מ&quot;ל α-ממ בינוני מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.5 פעמיים נוספות ותאי בריכה transfected להניב בנפח כולל של 10 מ&quot;ל. מוסיפים 10 מ&quot;ל תא ההשעיה (1.5 x 10 6 תאים) כדי T175 בקבוק המכיל 10 מ&quot;ל α-ממ בינוני מלא. כדאיות התא לאחר electroporation הוא כ 30%, תשואה של כ 4.5 x 10 5 תאים לכל קיימא T175. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה α-ממ להשלים בינוני 24 שעות לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר transfected תאים כאשר 70-80 ומחוברות% (~ 2 - 3 ימים לאחר electroporation). בצעו ספירת תאים באמצעות hemacytometer ו resuspend התאים בריכוז של 1.0 x 10 6cells/50 μL של המדיום α-ממ להשלים. מזעור התאים זמן לבלות ההשעיה כדי להפחית מוות של תאים לפני ההזרקה. </li></ol> 2. Intramyocardial Injection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות הרדמה על ידי isoflurane (פיניקס Pharmaceuticals, Inc, סנט ג&#39;וזף, מיזורי) על העכברים הטרנסגניים מהונדסים constitutively להביע Cre recombinase בכל תא (B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J, ג&#39;קסון מעבדה, בר הרבור, ME). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מאזור החזה באמצעות קוצץ שיער או שיער מסיר כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנרר עם קטטר 18 מד (בקטון דיקינסון ושות&#39;, פרנקלין לייקס NJ) ומקום למכונת הנשמה העכבר 120-130 נשימות לדקה עם נפח של שבץ μL 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך לרוחב פני השטח צלעי fourth ובכך לייצר פתיחת בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדמיין את הלב, לעשות שני 25 זריקות μL ההשעיה תא transfected באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל (Temuro רפואי Corporation, Somerset, NJ) ו - 28 מחט מד (Bectעל דיקינסון ושות&#39;, פרנקלין לייקס NJ). כדי להקל על הזרקת intramyocardial ולמנוע נזק מוגזם האיבר, לכופף את ראש מחט ~ 90 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזריקה, להשתמש בתפרים נספגים (למשל, vicryl) כדי לסגור את הצלעות שכבות השריר. עור תפר סגור באמצעות ניילון משי או 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי להתאושש הרדמה extubate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצות הבקרה צריכה לכלול עכברים Cre קבלת זריקות בינוני בלבד, עכברים Cre לקבל את אותו ריכוז של תאים untransfected ועכברים סוג בר קבלת תאים transfected (לחלופין, עכברים Cre קבלת תאים transfected לא נוטה הפתיל). </li></ol> 3. Biophotonic הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש עד חמש עשרה דקות לפני הדמיה, intraperitoneally (IP) להזריק 10 μL לגרם משקל גוף העכבר של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​D-Luciferin (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות הרדמה על עכברים באמצעות isoflurane ב 4% לזירוזד 1-2% לצורך תחזוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עכברים פרקדן בתיבת הדמיה עם facemask מתן 1-2% isoflurane עבור הרדמה תחזוקה (מערכת הדמיה Xenogen Biophotonic, Hopkinton, MA). מספר העכברים ניתן הדמיה במקביל. תמונה דמה עכבר שליטה עם עכברי הניסוי לצורך השוואה קלה של האות זורח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen), לקבוע זמן החשיפה המתאימה (בדרך כלל 60 שניות, לראות תוצאות). הגדרת שטח של התמונה כך שתתאים עכברים לשמור אזור עקביות לאורך הדמיה כדי למנוע שינויים ברגישות. קביעת גובה הנושא 4.5 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את עוצמת הארה האות המתאים העכבר או עכברים בתחום להציג ולשמור קבצי תמונה ללא שינוי. תמונות תהליך להסיר אות הרקע המתאים כדי לשלוט או עכבר unmanipulated. ערכים עוצמה מעל רקע מתאימות התאים התמזגו בתוך החיה. ניתוח עוצמת ניתן לבצע באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen) או קוד פתוח תוכנה לניתוח תמונה. T<html> ypically, באזור של עניין (ROI) נבחרה כדי להשוות נתונים בין עוצמת ניסויים בבעלי חיים. </li></ol> 4. נציג תוצאות כדי לקבוע את הרגישות של מערכת הדמיה Biophotonic Xenogen, קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר שריר הלב של C57/Bl6 עכברים (ג&#39;קסון מעבדה). הוזרקו תאים בריכוזים של 1 x 10 6, 1 x 10 3, או 1 1 x 10 תאים. שש שעות לאחר הלידה התא, הוזרקו לעכברים intraperitoneally עם luciferin הדמיה באמצעות מערכת Xenogen. אות מסוים יכול להיות מזוהה עם 1,000 תאים (2 של 6 עכברים הדמיה, איור 2), אבל היה זיהוי אמין יותר עם ​​10,000 תאים (6 מתוך 6 עכברים הדמיה). חשוב לציין כי מחקר זה שימש גם להקים מתאם גס בין מספר בלוציפראז-להביע תאים ועוצמת האות. &gt; כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול המתואר גילוי ומעקב אחר איחוי תאים, MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד (Addgene) ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע לאחר הלידה התא, העכברים היו הדמיה הראשון באמצעות מערכת Xenogen ללא הזרקה D-luciferin. כצפוי, ללא מצע האנזימטית, עוצמת האות לא זוהה (איור 3). בשלב הבא, D-luciferin שהוזרק intraperitoneally ואת האות המתאימה לעוצמת בלוציפראז ובכך איחוי תאים התגלה בשניים מתוך ארבעה עכברים שנבדקו. איתות דומה התגלתה שבוע מאוחר יותר (איור 3), מה שמרמז MSC מצמידים מוצרים היתוך יכול להישמר in vivo. במקרה זה, המחקר הופסק כדי לאפשר הערכה של הלב הרקמה שמסביב, אבל אפשר לחזות לטווח ארוך ניתוחים הדמיה תכופות יותר כדי לעקוב אחר התפשטות, תחזוקהד אולי הגירה של מוצרים היתוך בעכברים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של טכניקה לזהות Fusion Cell in vivo. היתוך בין אם Cre-לבטא בתאי עכבר התאים המושתלים להביע פלסמיד בלוציפראז floxed מתרחשת, בלוציפראז יבוא לידי ביטוי. בלוציפראז ניתן לאתר על ידי הזרקת המצע האנזימטית, D-luciferin, לעכבר ולאחר מכן הדמיה את העכבר באמצעות הדמיה Biophotonic Xenogen System (מעובד מתוך 19) <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" /> באיור 2. רגישות הזיהוי של בלוציפראז-להביע תאים ברקמת הלב עם הדמיה biophotonic. קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר בחלל intramyocardial C57/Bl6 של עכברים שונים מספרים על תא הכולל. נציג תמונות של עכברים מחדשceiving 1 x 10 6, 1 ו - 3 x 10 x 10 1 1 תאים (משמאל לימין) מוצגים, הדמיה נערך כ -6 שעות לאחר ההזרקה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" /> באיור 3. כימות בשנת הארה Vivo אינדיקטיביים של Fusion Cell. MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע ושבועיים לאחר הלידה התא, עכברים Cre היו הדמיה באמצעות מערכת Biophotonic Xenogen הדמיה כדי למדוד את עוצמת הארה מעיד על איחוי תאים. (א) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. (ב) עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. אזור של אינטרס נבחר (צהוב) המתאים הזריקה ואני עוצמתevels נקבעו באמצעות ImageJ (מקור חינם) תוכנה 20. (ג) עוצמת הארה היה מנורמל לאזור באותו עניין על זיוף העכבר על כל תנאי הניסוי. באותו שבוע, 3 ו -4 עכברים הראו אות הארה חיובי המצביע על היתוך ספונטני של תא עכבר MSC המושתלים. האות התמיד העכבר 3 ב שבועיים. כדי לקבוע איבר ספציפי לוקליזציה של האות המתאים העכבר 3, חלל בית החזה נחשף ואיברים העיקרי שנכרת הדמיה. (ד) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של העכבר 3. הערה לוקליזציה של עוצמת האות במעי הדק. (ה) עוצמת הארה של העכבר 3. (F) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף העכבר. (G) עוצמת הארה של זיוף העכבר.

<ol>
	<li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Human Placenta. , (2000).</li><li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta.">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li><li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia.">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li><li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+debris,+oxidative+stress+and+pre-eclampsia.">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li><li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo.">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li><li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion,+but+not+transdifferentiation.">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li><li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion.">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li><li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts.">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li><li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium.">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li><li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+(Kap)-luciferase+transgenic+mice.">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li><li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice:+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity.">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li><li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+(virB4),+GR024+(galE),+and+GR026+(BMEI1090-BMEI1091)+confer+protection+in+mice.">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li><li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice.">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li><li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model.">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li><li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice.">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li><li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation.">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li><li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+transplantation+in+rats:+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site.">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li><li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li><li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+cell+fusion.">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן מאפשר, לראשונה, זיהוי וניתוח בדידה הזמני של איחוי תאים באורגניזמים, כולל חיות קטנות. הגישה משלבת Cre-LoxP רקומבינציה עם ניתוח שלאחר מכן תמונה biophotonic. הגישה ניתנת למעקב לא רק תאים תאים היתוך, אלא גם וירוס תאים היתוך ולכן יכול להיות שימושי עבור מעקב אחר זיה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> נאון מערכת transfection </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> MPK5000 </td><td></td></tr><tr><td> נאון 100 μL Kit </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> MPK10025 </td><td> מכיל R ו-E הצפת </td></tr><tr><td> ממ, אבקת </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> Hyclone, לוגן UT </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J </td><td> ג&#39;קסון מעבדה, בר הרבור, ME </td><td> 006054 </td><td></td></tr><tr><td> 10X טריפסין </td><td> פישר סיינטיפיק, יער Lawn, NJ </tד&gt; <td> MT-25-054-Cl </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> פישר סיינטיפיק, יער Lawn, NJ </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Xenogen מערכת הדמיה Biophotonic </td><td> Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA </td><td> IVIS ספקטרום </td><td></td></tr><tr><td> נתרן Biocarbonate </td><td> סיגמא אולדריץ&#39;, סנט לואיס, מיזורי </td><td> S6014-500 גרם </td><td></td></tr><tr><td> שאינם חיוניים חומצות אמינו </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr></tbody></table>

a cre-lox p recombination approach for the detection of cell fusion in vivo

היכולת של שני תאים או יותר מאותו סוג הפתיל נוצל metazoans במהלך האבולוציה כדי ליצור איברים מורכבים רבים, כולל שרירים ועצמות השלד, ואת השליה. מחקרים עכשוויים מראים היתוך של תאים מאותו סוג מעניקה פונקציה משופרת. למשל, כאשר תאים trophoblast של הפתיל את השליה לטופס syncytiotrophoblast, syncytiotrophoblast הוא טוב מסוגל להעביר חומרים מזינים והורמונים דרך מחסום אימהית, העובר מאשר trophoblasts unfused 1-4. מחקרים מאוחרים יותר מראים היתוך של תאים מסוגים שונים יכול לכוון גורל התא. &quot;חזרה&quot; או שינוי גורל התא על ידי היתוך חשבו פעם להיות מוגבל במערכות תרבית תאים. אבל הופעתו של השתלת תא גזע הובילו לגילוי על ידינו ואחרים בתאי גזע יכול להתמזג עם תאים סומטיים in vivo ו היתוך המאפשר בידול תא גזע 5-7. לפיכך, המיזוג התא תהליך מוסדר גapable לקידום הישרדות התא בידול ולכן יכול להיות בעל חשיבות מרכזית לתיקון הפיתוח של רקמות ואפילו בפתוגנזה של המחלה. הגבלת המחקר של היתוך התא, הוא היעדר טכנולוגיה מתאימה 1) לזהות במדויק מוצרים היתוך ו 2) היתוך מוצרים לעקוב לאורך זמן. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לטיפול הן המגבלות באמצעות אינדוקציה של פליטת אור על היתוך (איור 1):. פליטת אור ניתן לאתר עם ​​רגישות גבוהה in vivo 8-15 אנו מנצלים לבנות קידוד בלוציפראז גחלילית (Photinus pyralis) הגן ממוקם בסמוך קודון להפסיק מוקף רצפים LoxP. כאשר תאים להביע את הפתיל גן עם תאים המבטאים את חלבון recombinase Cre, אתרי LoxP הם ביקע את האות לעצור הוא נכרת ומאפשר שעתוק של בלוציפראז. בגלל האות inducible, שכיחות חיוביות שגויות אותות נמוך מאוד. בניגוד לשיטות הקיימות אשר מנצלים את Cre / מערכת LoxP 16, 17, יש לנו שולבו &quot;חי&quot; אות זיהוי ובכך להרשות בפעם הראשונה את ההזדמנות כדי לעקוב אחר קינטיקה של איחוי תאים in vivo. כדי להדגים את הגישה, עכברים בכל מקום בגוף להביע Cre recombinase שימש מקבלי בתאי גזע transfected עם לבנות להביע את הזרם בלוציפראז של קודון עצירה floxed. בתאי גזע הושתלו באמצעות הזרקה intramyocardial ואחרי ניתוח השתלת intravital תמונה נערך כדי לעקוב אחר נוכחות היתוך מוצרים הלב הרקמות הסובבות לאורך זמן. גישה זו יכולה להיות מותאם לנתח איחוי תאים בכל סוג רקמה בכל שלב של המחלה ופיתוח, או לתקן רקמות מבוגר.

Watch this Scientific Journal Video about A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo at JoVE.com

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

שיטה כדי לעקוב אחר איחוי תא אורגניזמים חיים על פני זמן מתואר. הגישה מנצל Cre-<em&gt; LoxP</emרקומבינציה&gt; לגרום הביטוי בלוציפראז על איחוי תאים. האות זורח שנוצר ניתן להבחין יצורים חיים באמצעות מערכות הדמיה biophotonic עם רגישות של גילוי של ~ 1,000 תאים ברקמות היקפי.

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

a-cre-lox-p-recombination-approach-for-detection-cell-fusion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

18.7K Views.  University of Wisconsin-Madison. שיטה כדי לעקוב אחר איחוי תא אורגניזמים חיים על פני זמן מתואר. הגישה מנצל Cre- LoxP לגרום הביטוי בלוציפראז על איחוי תאים. האות זורח שנוצר ניתן להבחין יצורים חיים באמצעות מערכות הדמיה biophotonic עם רגישות של גילוי של ~ 1,000 תאים ברקמות היקפי.

Video: A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, environmental/agricultural/biodefense monitoring, nanobiotechnology, and more. For diagnostic applications, monitoring (detecting) the presence, absence, or abnormal expression of targeted proteomic or genomic biomarkers found in patient samples can be used to determine treatment approaches or therapy efficacy. In the research arena, information on molecular affinities and specificities are useful for fully characterizing the systems under investigation.
Many of the current systems employed to determine molecular concentrations or affinities rely on the use of labels. Examples of these systems include immunoassays such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR) techniques, gel electrophoresis assays, and mass spectrometry (MS). Generally, these labels are fluorescent, radiological, or colorimetric in nature and are directly or indirectly attached to the molecular target of interest. Though the use of labels is widely accepted and has some benefits, there are drawbacks which are stimulating the development of new label-free methods for measuring these interactions. These drawbacks include practical facets such as increased assay cost, reagent lifespan and usability, storage and safety concerns, wasted time and effort in labelling, and variability among the different reagents due to the labelling processes or labels themselves. On a scientific research basis, the use of these labels can also introduce difficulties such as concerns with effects on protein functionality/structure due to the presence of the attached labels and the inability to directly measure the interactions in real time.
Presented here is the use of a new label-free optical biosensor that is amenable to microarray studies, termed the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), for detecting proteins, DNA, antigenic material, whole pathogens (virions) and other biological material. The IRIS system has been demonstrated to have high sensitivity, precision, and reproducibility for different biomolecular interactions [1-3]. Benefits include multiplex imaging capacity, real time and endpoint measurement capabilities, and other high-throughput attributes such as reduced reagent consumption and a reduction in assay times. Additionally, the IRIS platform is simple to use, requires inexpensive equipment, and utilizes silicon-based solid phase assay components making it compatible with many contemporary surface chemistry approaches.
Here, we present the use of the IRIS system from preparation of probe arrays to incubation and measurement of target binding to analysis of the results in an endpoint format. The model system will be the capture of target antibodies which are specific for human serum albumin (HSA) on HSA-spotted substrates.

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Quantitative, high-throughput, real-time, and label-free biomolecular detection (DNA, protein, etc.) on SiO2 surfaces can be achieved using a simple interferometric technique which relies on LED illumination, minimal optical components, and a camera. The Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS) is inexpensive, simple to use, and amenable to microarray formats.

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...