אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (מספר הפרס DE-FG02-91ER20021) ואת הקרן הלאומית למדע (MCB 0948584) (FB). אנו אסירי תודה על קרן בירד גב לעריכה את כתב היד.

1. EMS טיפול זרעים thaliana ארבידופסיס הם mutagenized משתמש כמו sulfonate mutagen אתיל מתאן סוכן (EMS) 3,4, אשר מעוררת את ה-C-ל-T משתנה הגנום וכתוצאה מכך C / G ל T / A מוטציות 5-7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.8 גרם זרעי ארבידופסיס (~~~HEAD=NNS 40,000 זרעים) הנושאים את הסמן ניאון אברון (באופן ספציפי, במחקר זה ssGFPHDEL (רצף ה-GFP-HDEL האות tetrapeptide) שימש כסמן ER). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הזרעים צינור פלקון 50 מ&quot;ל, ואז מוסיפים 25 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2% (V / V) sulfonate אתיל מתאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 16 שעות על nutating המיקסר במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזלים וזורקים אותו לתוך בקבוק המכיל 1.0 M NaOH להשבית EMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל מים לצינור פלקון המכיל את הזרעים, קרוב, ללא מרחב זה 5 פעמים לשטוף את הזרעים; לחכות עד שכל הזרעים יכולים להגיע, אז לשאוב מים וזורקים לתוך M 1.0 Na<html> OH הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב כביסה עד 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, שוב להשעות את הזרעים בכמות מינימלית של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עיקור זרע הוספת 25 מ&quot;ל של אקונומיקה 10%, לנער במרץ ל -30 זה. בואו זרעים להתיישב למטה, ואז לשפוך את אקונומיקה ולשטוף עם 25 מ&quot;ל של מים סטריליים. יוצקים מעל מים סטריליים ולהוסיף 25 מ&quot;ל אתנול 70%. ללחוץ על צינורות של 30. בואו זרעים להתיישב למטה. יוצקים את אתנול ולשטוף עם 25 מ&quot;ל של מים סטריליים. חזור פעמיים לשטוף עם מים סטריליים, ואז לשפוך זרעים על צלחת פטרי פלסטיק המכיל 3 נייר פילטר MM ולתת יבש מתחת למכסה המנוע. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת את הזרעים על ½ MS phytagel (ריכוז חצי בינוני Murashige ו Skoog), 150 מ&quot;מ צלחת פטרי (~~~HEAD=NNS 250-300 הזרעים צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זרעים M1 על צלחת 2 שבועות, ולאחר מכן השתלת לתוך האדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף זרעים מצמחים מסוג M2 M1 בודדים ליצור קווים M2 (1000 שורות עצמאיים). </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. הקרנת Confocal אוכלוסיות M2 ו M3 בחלק זה אנו מתארים את התצפית של שתילים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או כמתואר לעיל 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שישים זרעים של כל קו M2 גדלים במשך 7 עד 10 ימים פלסטיק צלחות פטרי, ½ MS phytagel, על אותה צלחת גדלים גם 5 שתילי-EMS מטופלים (שליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש עד עשר cotyledons מורכבים עם הצד abaxial לכיוון העדשה (40X) בשקופית המיקרוסקופ המצורף coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל טבורית הוא ציין, בין קליפת המוח באזור המדיאלי, תחת הקרינה להפצה בכל subcellular שונה של הסמן אברון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמחים חיוביים מושתלים לתוך האדמה וזרעי שלהם נאספים הוקרן שוב כדי לאשר את פנוטיפ מוטנטי בדור M3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת מזהמים מוטציות רקע דרך backcrossing לפחות שלוש פעמים כדי הגנום wild-type לשתף ואוליntaining את הסמן הרצוי אברון ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצמח האם, בעזרת מספריים עדינים או מלקחיים להסיר siliques בוגרים, פרחים פתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות כי הם קטנים מדי מן meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה זוג אחד מלקחיים בין עלי הכותרת ואת עלי גביע לפתוח 1 ניצן הפרח ולהסיר את כל המאבקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות זוג מלקחיים לקחת פרח בוגרת פתוח מצמח האב לשפשף את המאבקים על הסטיגמה של הצמח מסורס. </li></ol></li></ol> 3. מיפוי סעיף זה מתאר למעשה כיצד למפות מוטציה רצסיבית באמצעות פרוטוקול שונה מ Borevitz 9 שהוא מהיר יותר אם לעומת שיטות מיפוי מסורתיות 10,11. גישה זו להשתמש צפיפות גבוהה מערכי oligonucleotide את היכולת לזהות מספר רב של פולימורפיזמים תכונה אחת (SFPs) ב assay אחת 12. שימוש ATH1 ארבידופסיס Affymetrix מערך GeneChip ניתןלנתח כ 24,000 גנים. מאגר של F 2 אנשים המציגים את המוטציה משווים למאגר של wild-type f 2 צמחים שנאספו בקרב האוכלוסייה לבודד אותה. לאחר מכן, מוטציה ימופו באזור שבו בריכת מוטציה בו מועשרת עבור אללים מוטנטים גנוטיפ ולכן באותו אזור הבריכה wild-type תגרום מועשר עבור wild-type אללים הוריות 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ&quot;א הגנומי (3 מיקרוגרם) מופק הומוזיגוטים מוטציה קולומביה (M3) באמצעות DNeasy Qiagen ערכת מיני הצומח מוגש על הגנום Illumina Analyzer II (II GA) 14 סידור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוזיגוטים מוטציה קולומביה (M3) הוא חצה עם לנדסברג erecta ליצור מיפוי האוכלוסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיפוי מבוצע על 70 עד 100 אנשים F2 מראה פנוטיפ סוטה ואת אותו מספר של צמחים F2 פנוטיפ עם wild-type. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מצמח כל דיסק עלה (0.60 מ&quot;מ) באמצעות אגרוף חור.הדיסק עלה יש לאסוף מן העלים באותו גיל כדי להיות בטוח יש כמויות דומות של DNA. דוגמאות ניתן לעבד להפקת הגנומי בנפרד או בקבוצות. במקרה זה, ניתן לאסוף דגימות 5-10 עבור כל צינור Eppendorf כך שבסופו של דבר יהיה לך פחות צינורות eppendorf שממנו הדנ&quot;א הגנומי יש צורך לעקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליף MasterPure הצמח DNA טיהור Kit (Epicentre) משמש כדי לחלץ את ה-DNA הגנומי. ה-DNA הגנומי להשיג מדגם זה היא לכמת עם nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותה כמות של הדנ&quot;א הגנומי מכל מדגם לאחר מכן, ביחד עד לסך של 300 ננוגרם (~ 30 μL) של DNAs צמחים, מוסיפים 60 μL פתרון primers 2.5x אקראית [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 מ&quot;מ MgCl2, 25 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol, 750 מיקרוגרם / primers oligodeoxyribonucleotide מ&quot;ל (octamers אקראיים)] (Bioprime בערכה) ו 42 מים μL (μL הסופי נפח 132). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל DNAs ב&gt; 95 ° C במשך 5 דקות עד 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה denatuאדום DNA להוסיף 15 μL תערובת dNTPs 10X עם ביוטין dCTP [1 mM ביוטין-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 מ&quot;מ dATP, 2 מ&quot;מ dGTP, 2 מ&quot;מ dTTP ב 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime הערכה), ולהשלים עם פולימראז 3 Klenow μL (ערכת Bioprime). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 15 μL 3 מ &#39;ו 400 NaOAc μL EtOH 100% קר, ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן להסתובב ב XG 20,500 במשך 15 דקות, להסיר supernatant, ולשטוף עם EtOH μL 500 75% קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסובבים XG 20,500 עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דנ&quot;א כדורי יבש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ו resuspend במים 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 μL לבדוק התפוקה והאיכות על ג&#39;ל (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח 95 μL של תיוג תגובה עבור פראי סוג של מוטציה GeneChip הכלאה ATH1 ארבידופסיס הגנום המערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכים את נסרקים ואת. CEL קבצים שהתקבלו מנותחות באמצעות תוכנת R ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>RG /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת תוכנה R, ולאחר מכן פתח את התוכנית ולהדביק את המחרוזת הבאה: המקור (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () לאחר מכן לחצו על מקש החזרה, זה להתקין את החבילות Bioconductor סטנדרטיים ( <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיקייה חדשה על שולחן העבודה, להוריד מאתר האינטרנט הבא ( <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) את הקבצים: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip ColLerCEL.zip הקובץ יש פרקה את הקבצים המתקבלים להדביק את התיקיה החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה שם את הנתונים שהתקבלו בניסוי GeneChip שלך wildtype.CEL ו mutant.CEL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להעתיק נתונים GeneChip שלך (wildtype.CEL וmutant.CEL) לתוך התיקיה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ר &#39;, א) עבור Mac: לחץ על &quot;שונות&quot;, ולאחר מכן לחץ על &quot;מדריך שינוי עבודה.&quot; ב) עבור ה-PC: לחץ על &quot;קובץ&quot; ואז &quot;מדריך שינוי&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) עבור Mac: בחר את התיקייה המכילה את הקבצים. לחץ על &quot;סביבת עבודה&quot;, &quot;סביבת עבודה קובץ טען&quot; ובחר ath1V5.RData, ב) עבור ה-PC: בחר את התיקייה המכילה את הקבצים הנ&quot;ל, לחץ על &quot;קובץ&quot; ואז &quot;טען סביבת עבודה&quot; ובחר ath1V5.RData. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ReadCEL.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SFP.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Map.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון מסוף תראה את ההודעה הבאה: כרומוזום X מגביל Mb YZ גנים החיפוש תאיר ולהדביק בקישור הזה 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; בסוף = Z </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק והדבק את הקישור בדפדפן האינטרנט שלך. יופיע חלון ולבקש לפתוח או לשמור את הקובץ, עליך לבחור לשמור. בחר שם הקובץ ולצרף את הסיומת &quot;. Xls,&quot; ולאחר מכן לחץ על שמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ &quot;. Xls&quot; שבו אתה יכול למצוא את הקואורדינטות של מוטציה שלך (התוצאה מוצגת באופן גרפי באיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחום ממופה ב Illumina התאספו קורא הגנום המוטנטי לזהות ספציפיים מעברים צוות האמבולנס 4 בין פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד. להשלים את פנוטיפ מוטנטי של הגן עם השינוי בסוג בר (ים) באמצעות הליכים רגילים 15. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 1 מציג את הגישה המשמש זיהוי מוטציה של מסלול הפרשה באמצעות הקרנת מיקרוסקופיה confocal. תרשים 2 מציג הכנה טיפוסי של ה-DNA הגנומי שכותרתו עבור מערך ההכלאה. ב 3 דמות, תוצאה אופיינית צפוי לאחר ניתוח נתונים המתקבלים מערך ארבידופסיס GeneChip הגנום ATH1 מוצג. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> באיור 1. הצמחים הטרנסגניים ארבידופסיס המבטאים ssGFPHDEL (ER סמן) (1) עובדו כדי לייצר זרעים מספיק עבור EMS טיפול (2). זרעים שטופלו EMS נזרעו אז כדי לייצר צמחים M1 (3). כל צמח M1 מייצג קו שונה זרע נאספו בנפרד כל אחד מהם. זרע M2 היו מצופה על מצע MS ½ (4) ו הוקרן מכן על ידי מיקרוסקופ confocal (5) על פגמים מורפולוגיה ER. במהלך ההקרנה מצאנו צמחים שימור מורפולוגיה wild-type ER (6), צמחים המראים פגומים פנוטיפים ER (7). צמחים אלו גדלו להשיג את הדור M3 ו לאשר את הפנוטיפ (8). הדנ&quot;א הגנומי מצמח M3 שימש Solexa Illumina רצף (א). אותו צמחשימש גם צלבים עם הימלר-WT לקבל מיפוי האוכלוסייה F2 (ב). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> 2. איור Bioprime אקראיים תיוג תגובות (5 μL של μL 100) הועמסו על 1% agarose ג&#39;ל. ליין היא מתוך מאגר של צמחי הבר מסוג F2, וליין B היא מתוך מאגר של צמחים מוטנטים F2. (דה מרקר הוא 1 Kb DNA הסולם-N3232, החל חוד). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> איור 3. דמות מייצגת דוגמה מיפוי של מוטציה Col-0 ארבידופסיס באמצעות GeneChip ATH1 הגנום הכלאה המערך. מוטציה בדוגמה זו ממוקמת על תחום כרומוזום 1, על ידי קווים אנכיים. הסורגים האופקיים מייצגים את סף לצורך זיהוי.

<ol>
	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis.">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li><li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+Arabidopsis.">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li><li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li><li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants.">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li><li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants.">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li><li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Golgi+apparatus:+from+imaging+to+genes.">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li><li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays.">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li><li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers.">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li><li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis.">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li><li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression.">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li><li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis.">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis.">Arabidopsis.</a> A Laboratory Manual. , (2002).</li><li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology.">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

כאן תיארנו ההקרנה confocal מיקרוסקופיה מבוססת על זיהוי של מוטציות endomembrane. גישה זו ניתן להרחיב בקלות אברונים אחרים של התא עבורו סמנים ספציפיים חלבון פלואורסצנטי הזמינים. המסך מבוסס על זיהוי של מוטנטים המציגים התפלגות חריגה של סמן פלואורסצנטי בין אם אברון היעד או אברונים...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ethylmethane sulfonate </td><td> סיגמא </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT בייקר </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige skoog הבסיס בינוני * פרנסות gamborg ויטמינים </td><td> פיטו technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> סיגמא </td><td> P8169-1 ק&quot;ג </td></tr><tr><td> ערכת RNeasy מיני </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> הורים צמח טהור עלה DNA ערכת טיהור </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> ה-DNA Bioprime תיוג מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> 200 אלכוהול הוכחה </td><td> Decan מעבדות Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT בייקר </td><td></td></tr><tr><td> שבב גנטי ארבידופסיס ATH1הגנום מערך </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> פלקון צינורות 50 מ&quot;ל </td><td> קורנינג </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Eppendorf מבחנות 1.5 מ&quot;ל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נייר סינון 90 מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> אנליטי מאזן </td><td> Mettler טולדו AB54-S </td><td> נה </td></tr><tr><td> Nutating (גל) שאכר </td><td> Heidolph polymax 1040 </td><td> נה </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> נה </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

פרוטוקול זה מתאר סינון הקרינה המיקרוסקופ מבוסס על שתילים ארבידופסיס ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיבי אשר משנים את חלוקת subcellular של סמן מסוים ניאון מתויג במסלול הפרשה. ארבידופסיס הוא מודל ביולוגי רב עוצמה למחקרים גנטיים בגלל גודל הגנום שלו, זמן דור, ושימור של המנגנונים המולקולריים בין הממלכות. מערך genotyping כגישה למפות מוטציה חלופה לשיטה המסורתית המבוססת על סמנים מולקולריים יש יתרון משום שהוא הוא יחסית מהיר יותר עשוי לאפשר מיפוי של מוטציות מספר פרק זמן קצר מאוד. שיטה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים אשר יכולים להשפיע על שלמות אברון כל בצמחים. הנה, לדוגמה, אנו מציעים מסך לגנים מפת חשובים שלמות של reticulum endoplasmic (ER). הגישה שלנו, לעומת זאת, ניתן להרחיב בקלות אברונים תאים אחרים צמחים(לדוגמה לראות 1,2), ובכך מייצג צעד חשוב לקראת הבנת הבסיס המולקולרי השולט מבנים subcellular אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity at JoVE.com

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  Michigan State University. בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים ר?...

Video: Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...