המחברים מבקשים להודות צבא ארה&quot;ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (גרנט # W81XWH-10-1-0806) ואת מכון הבריאות הלאומי (מענק # U19 AI091031-01 וגרנט # 1R01GM090280) עבור תמיכה כספית. BN מודה Professorship Balloun ב כימיים והנדסה ביולוגית ו NLBP מודה Professorship וילקינסון להנדסה הבינתחומי. אנו מודים ג&#39;וליה ולה על עזרתה בביצוע ניסויים functionalization nanoparticle.

1. תפוקה גבוהה פחמימות סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סינתזה אוטומטית של dimannoside, התורם סוכר מוגן כראוי, בדרך כלל trichloroacetimidate, ו acceptor, בעיקר אלכוהול fluorous alkenyl, מסונתזים על העליונה הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנית כתוב לסינתזה אוטומטי של dimannoside. ייצוג סכמטי של הליך אוטומטי בסיסי מוצג באיור 2. בתוכנית, הוא הבטיח כי לפני תוספת של האמרגן, תערובת של התורם acceptor הוא עורר דקות לפחות 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות של acceptor סינטטי התורם, והוא trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate מתקבלות dichloromethane. טולואן dichloromethane משמשים לרוב לתגובות glycosylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, להכין פתרונות של חומרים כימיים עבור deprotection של קבוצות הגנה זמניים מתנול 80% ו 100% מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התוכנית, להבטיח כי relatלחות ive בחדר היא 30% או נמוך בתא אוטומציה. לחות גבוהה מזיקה לתגובות glycosylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תוכנית כלשהי, תוכנית זרוע רובוטית מעבירה את הפתרונות של התורם acceptor לתוך בקבוקון התגובה ברצף. לאחר מכן התערובת הוא עורר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא את הזרוע הרובוטית מעביר 0.2 עד 0.3 ושווי של trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate לתוך התערובת, בדרך כלל בטמפרטורת החדר אך בטמפרטורות נמוכות יותר כמו -20 מעלות צלזיוס ניתן להשיג. תערובת התגובה היא עוררה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות, התגובה היא עצרה aliquot קטן הסיר כדי לפקח על ההתקדמות התגובה. אם לא מלאה, התגובה יכולה להמשיך, ובסופו של דבר את הזמן הנדרש יכול להיות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובה הושלמה, התגובה התערובת מועברת על fluorous מוצקים מיצוי שלב (FSPE) מחסניות המכילות C 8 F-17 שונה סיליקה ג&#39;ל לטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העגלהרכסים נשטפים 1 בתערובת מתנול, מים 80% (8 מ&quot;ל) להיפטר חלק בלתי fluorous. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז המחסניות נשטפים עם מתנול 100% כדי להשיג את המוצר fluorous-מתויג הרצוי. אם טיהור נוסף הוא הרצוי, המכונה ניתן פסק המוצר התגובה (ים) להסיר לטיהור באמצעים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מחזור טיהור, זרוע רובוטית מחלק methoxide נתרן לתוך בקבוקון התגובה. התגובה היא עוררה עבור שעות 2. אם לא מלאה, התגובה יכולה להיות שוב נמשך תקופה ארוכה יותר, ובסופו של דבר הזמן מתוכנת הנדרש יכול להיות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת התגובה, המוצר מטוהרים על ידי FSPE וכפופים ואחר כך פירוק של טולואן נטול מים ואחריו אידוי מים כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן במחזור (מ שלב 6 עד 13) חוזר על עצמו עד אורך השרשרת הרצוי מתקבל עבור המולקולה היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוצר מוגן להשיג אוטומציה היא הen מטוהרים נוסף מאופיין במלואו על ידי טכניקות כגון תהודה מגנטית גרעינית וספקטרוסקופיה (NMR). Deprotection מלאה (הסרה של כל קבוצות הגנה הנותרים) של מולקולת המטרה הסופית הושלמה אז מחוץ פלטפורמת אוטומציה ככלל כי זה בדרך כלל גז מימן פלדיום נפץ. צעד deprotection הסופי בוצע על העליונה הספסל מחוץ פלטפורמת אוטומציה. הצעד הראשון היה ozonolysis של הקשר הכפול תג fluorous ואחריו חמצון אלדהיד המיוצר לחומצה carboxylic. המוצר היה מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה בעמודה. השלב האחרון היה deprotection של קבוצות האתר בנזיל ידי הידרוגנציה פלדיום catalyzed. המוצר עבר דרך celite משטח להיפטר פלדיום לקבל את המוצר הסופי טהור. </li></ol> 2. תפוקה גבוהה משטח Nanoparticle functionalization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוקה גבוהה סינתזה פולימר ייצור nanoparticle מתבצעת בעקבות יחסי ציבור באותוotocol ו רובוטית להגדיר שתואר על ידי פטרסון ואח&#39; 19. מערכות קופולימר המשמשים ייצור החלקיקים מבוססים על חומצה sebacic (SA) ו - 1,6-bis (para-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), ו 1,8-bis ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) ו CPH. ייצוג סכמטי של המנגנון בתצהיר רובוטית מנוצל מוצג באיור 1 ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ייצור nanoparticle, בעל המכיל צינורות עם הספרייה nanoparticle הוא לחבר מחדש לשלב מפעיל ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הקשר של פחמימות לפני השטח של חלקיקי polyanhydride, אמין, carboxylic צימוד חומצה תגובה 20 המורכב משתי תגובות רצופות מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על התגובה הראשונה, את המזרק משאבת מזרק 1 לתכנות מלא (10 ושווי eq.) (שווי של ריכוז חומצת טוחנת הממוצע carboxylic על פני החלקיקים) של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-CArbodiimide hydrochloride (EDC) ו 10 EQ. של ethylenediamine בתמיסה מימית, בעוד את המזרק משאבת מזרק 2 לתכנות טעון עם EQ 12. של N-hydroxysuccinimide (NHS) בתמיסה מימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת LabVIEW, המתלים מגיב אף הם לזכות * הספרייה nanoparticle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, כל דגימה היא sonicated (30 של הרץ 40) ובעל צינורית מנותקת פלטפורמה רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים nanoparticle מודגרת במשך 9 ** H עם סיבוב קבוע על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי זמן תגובה הושלמה, צינורות centrifuged (12,000 XG דקות 5) וחזרה לתחנת רובוטית לבצע שני צעדים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכביסה, מזרק נשאר ריק טעון משאבת מזרק 1 לתכנות תוך המזרק משאבת מזרק 2 מלא מים קרים. Supernatant בצינור כל אחד מכונס בתוך מזרק ריק הפקדונות משאבת השנייה במים קרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenization של ננוההשעיה החלקיקים מתבצע כמתואר על צעד 2.6. צינורות centrifuged מכן (12,000 XG דקות 5), צעד לשטוף 2 מבוצעת כמתואר על צעד 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה 2, שני צעדים בתצהיר משמשים. בשלב בתצהיר הראשון, 12 EQ. EDC של נטענים עם משאבה אחת 12 EQ. שירותי הבריאות של נטענים עם המשאבה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד בתצהיר 2 כולל 10 EQ. של saccharide ספציפי על המשאבות הראשון והשני (כלומר, גלקטוז, לקטוז או di-מנוז) *** ואת משאבת 3 עם EQ 10. של חומצה גליקולית (משמש השליטה ****). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים nanoparticle הוא נאחד את כמתואר על הצעד 2.6 ו מודגרות עבור H 9 עם סיבוב קבוע על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן התגובה הושלמה, צעד לשטוף מבוצעת כמתואר 2.8 צעדים, 2.9 ו 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספרייה nanoparticle פונקציונליות ממוקם מכן בתא ואקום להתייבש במשך שעה לפחות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקים פונקציונליות הם אז האופיציון תקן של ספקטרוסקופיה רנטגן Photoelectron ו assay גבוהה התפוקה פנול, חומצה גופרתית כדי לקבוע את הרכב פני השטח וריכוז saccharide בהתאמה. מיקרוסקופיית אלקטרונים פיזור אור דינאמי מנוצלים כדי לקבוע גודל החלקיקים, התפלגות גודל, ולחייב פני השטח. </li></ol> הערות: * כרכים הפקדת להשתנות עם המסה של חלקיקים המצויים צינור אחד. ראה הערה זמני התגובה עבור תגובות הראשון והשני ניתן לשנות כדי להתאים את ריכוז saccharide הסופי. *** כל saccharide מופקד לתוך מבחנות, תלוי הקבוצה הרצויה. **** לתגובה ספציפית מועסקים במחקר זה על החיבור של פחמימות, חומצה גליקולית משמש פקד מקשר מאז saccharides deprotected כבר יש את המולקולה קשורה קוולנטית, המאפשרת התקשרות נוספת אל פני השטח nanoparticle. 3. נציג תוצאות פולdimannoside LY מוגן שמוצג באיור 2 היה מסונתז באמצעות פלטפורמת אוטומציה. מתחם מסונתז התאפיין 1 H NMR ב ספקטרומטר 400 MHz VXR באמצעות CDCl 3 ממס. ספקטרום NMR מוצגת באיור 3. ניצול ייצור תפוקה גבוהה nanoparticle ו functionalization של polyanhydride חלקיקים המתואר כאן, מצורף של dimannose, לקטוז וגלקטוז בוצע בהצלחה 10, 11. באמצעות הגדרת, התנאים התגובה אופטימליים (כלומר, טמפרטורת התגובה וזמן) זוהו להשיג functionalization nanoparticle הרצוי ומורפולוגיה. כאשר התגובה בוצעה על 4 מעלות צלזיוס במקום בטמפרטורת החדר, הפחתת הצטברות nanoparticle נצפתה על ידי SEM (מידע לא מוצג). טבלה 1 מציגה תוצאות נציג של אפיון של CPTEG 50:50 פונקציונליות: חלקיקים CPH גם עם DI-מנוז אולקטוז, מסונתז על 4 ° C. הנתונים מצביעים על עלייה קטנה בקוטר nanoparticle הממוצע בשל functionalization. בעוד הלא פונקציונליות חלקיקים היה פוטנציאל שלילי של כ zeta. -20 MV, חלקיקים פונקציונליות הראה ערך חיובי זיטה פוטנציאל, הוכחת functionalization מוצלח של nanoparticle פני השטח. לקטוז DI-מנוז הן סוכרים נייטרליות, אולם קבוצות האמין חינם של אתילן diamine מקשר מנוצל כדי לצרף את saccharides עשוי להיות אחראי פוטנציאל זטה חיובית. זמן התגובה הוא משתנה נוסף שיכול להשפיע הן על מורפולוגיה הסופי של חלקיקים ואת מידת הקשר סוכר מושגת. על ידי התאמת זמן תגובה, ריכוז הסוכר הסופי מחובר אל פני השטח חלקיקים יכול להיות נשלט, כפי שמוצג באיור 4 א. כצפוי, ריכוז dimannose על פני השטח של 50:50 CPTEG: CPH חלקיקים מוגברת עםהזמן הכולל של התגובה והגיע לכל היותר אחרי שעה 18. חלקיקים פונקציונליות עם הזמן 24 שעות התגובה הכולל שימשו להעריך את יכולתם למקד CLRs על העכבר מח עצם תאים דנדריטים הנגזרים (DCS). Cytometry זרימת שימש כדי להעריך את הביטוי של שני קולטנים Cl (כלומר, CIRE (CD209, DC-סימן) ו הקולטן מנוז (CD206)) לאחר גירוי עם הלא פונקציונליות, ו לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליות (איור 4B). ביטוי גבוה יותר של קולטנים הצדדים, אשר מעידים על מיקוד יעיל, הושג כאשר תאים היו מגורה עם שני לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליות. עם זאת, די, מנוז, פונקציונליות חלקיקים הראו רמה גבוהה יותר של ביטוי המציין הספציפיות של ליגנד זה הקולטנים שהיו הנלמדים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Nanoparticle סוג </td><td> חלקיקים בקוטר ממוצע (ננומטר) </td><td> שד &#39;זעם החלקיקים ζ-פוטנציאל (mV) </td></tr><tr><td> ללא פונקציונליות </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0.6 </td></tr><tr><td> לקטוז </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2.4 </td></tr><tr><td> Di-מנוז </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4.2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. אפיון Nanoparticle. ללא פונקציונליות לבין פונקציונליות התאפיינו פיזור אור אלסטי מעין ומדידות זטא פוטנציאליים. גודל החלקיקים הנתונים מייצגים את הערך הממוצע ± סטיית תקן (SD) של נתונים דינמיים פיזור האור שנאספו שלושה ניסויים בלתי תלויים. נתונים זטא פוטנציאליים מייצגים ערך ממוצע ± סטיית תקן של שלוש קריאות עצמאיים. שינוי סימן של פוטנציאל זטה מוכיח כי הסוכר היה מצומדות ביעילות CPTEG 50:50: משטח nanoparticle CPH. <img alt="איור 1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1 (א) ייצוג גרפי של גישה רדף עם functionalization פחמימות של חלקיקים polyanhydride ודוגמה של ספריות nanoparticle פונקציונליות שיכול להיות מתוכנן עם גישה תפוקה גבוהה תיאר. (ב) ייצוג סכמטי של המנגנון האוטומטי בתצהיר ישמש functionalization החלקיקים, אשר מורכב (אני) שלושה NE 1000 משאבות, (ב) שלב רובוטית משולב על ידי שני מפעילים (Zaber): אחד עבור תנועה בכיוון x והשני תנועה בכיוון y: (ג) שלב 2 רובוטית עם שני מדפים סמוכים (מתאים צינורות cuvettes) בהרכב של שלושה מפעילים, אחד לכל כיוון (X, Y ו-Z). המשאבות, בסך הכל חמישה מפעילים מחוברים בסדרה. מפעילים משאבות מופעלות על ידי מחשב באמצעות תוכנת LabVIEW. בתרשים זה לא קנה מידה.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג גרפי של אוטומטי חוזר ונשנה סינתזה של פחמימות באמצעות מנוז כדוגמה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> איור 3. 1 H NMR של dimannoside מוגן. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> איור 4. () השפעת זמן התגובה על ריכוז nanoparticle פני השטח של saccharide. את הנתונים המוצגים, 50:50 CPTEG: חלקיקים CPH היו פונקציונליות עם dimannose לפעמים תגובה אחרת והתגובה בוצע ב 4 ° C. השגיאה הממוצע ורמת בשני ניסויים בלתי תלויים functionalization מוצג. (ב) לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליותלמעשה היעד הקולטן DC-סימן (CIRE, CD209) ו מנוז (CD206) על מח עצם שמקורם תאים דנדריטים כפי שתואר על ידי ביטוי מוגבר של שני סמנים לאחר גירוי עם CPTEG 50:50 פונקציונליות: חלקיקים CPH בהשוואה הביטוי המתקבל עם הלא פונקציונליות חלקיקים.

<ol>
	<li>Zepp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+vacine+design-lessons+from+nature.">Principles of vacine design-lessons from nature.</a> Vaccine. 28, C14-C24 (2010).</li><li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation.">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li><li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release.">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li><li>Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants.">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li><li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells.">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li><li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres.">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).</li><li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products:+Consequences+for+controlled+release+formulations.">Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li><li>Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation,+stabilization,+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres.">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).</li><li>Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+immune+response+of+alveolar+macrophages+by+targeting+different+C-type+lectin+receptors+using+"pathogen-like"+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticles.">Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles.</a> Biomaterials. , (2011).</li><li>Carrillo-Conde, B., Song, E. -. H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mannose-functionalized+"pathogen-like"+polyanhydride+nanoparticles+target+C-type+lectin+receptors+on+dendritic+cells.">Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells.</a> Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).</li><li>Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipilic+polyanhydrides+for+stabilization+of+Yersinia+pestis+antigens.">Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens.</a> Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li><li>Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dendritic+cells+with+biomaterials:+developing+the+next+generation+of+vaccines.">Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines.</a> Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).</li><li>Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+C-type+lectin+specific+for+galactose/N-acetylgalactosamine+is+an+endocytic+receptor+expressed+on+monocyte-derived+immature+dendritic+cells.">The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 20686 (2002).</li><li>Geijtenbeek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+through+C-type+lectin+receptors:+shaping+immune+responses.">Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).</li><li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+oligosaccharide+synthesis.">Automated oligosaccharide synthesis.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).</li><li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Carbohydrate+Synthesis+as+Platform+to+Address+Fundamental+Aspects+of+Glycobiology-Current+Status+and+Future+Challenges.">Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges.</a> Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).</li><li>Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+solution-phase+automated+iterative+synthesis:+fluorous-tag+assisted+solution-phase+synthesis+of+linear+and+branched+mannose+oligomers.">Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).</li><li>Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+and+high-throughput+protein+release+from+polymer+film+and+nanoparticle+libraries.">Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Song, E. -. H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+multivalent+tuberculosis+and+Leishmania-associated+capping+carbohydrates+reveals+structure-dependent+responses+allowing+immune+evasion.">Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).</li><li>Hakamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+glycosylation+in+tumor+and+tumor+associated+carbohydrate+antigens.">Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens.</a> Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).</li><li>Atherton, T., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-phase peptide synthesis: a practical approach. , (1999).</li><li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+synthesis+machines:+DNA+chemistry+and+the+uses.">Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses.</a> Science. 230, 281-285 (1985).</li><li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides.">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li><li>Ko, K. -. S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines.">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li><li>Pohl, N. L., Chen, X. H. R., Wang, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+solution-phase+oligosaccharide+synthesis+and+carbohydrate+microarrays:+development+of+fluorous-based+tools+for+glycomics.">Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics.</a> Chemical Glycobiology. , 272-287 (2008).</li></ol>

NLBP הוא המייסד ובעל מניות בחברה פחמימות LuCella Biosciences, Inc

היעילות של פחמימות כמו מיקוד סוכנים אינטראקציות nanoparticle ישירות לתאי מערכת החיסון הוכח בעבר 10, 11. מחקר קודם במעבדות שלנו הראו כי סוכרים ספציפיים המחוברים חלקיקים polyanhydride מסוגלים למקד CLRs שונים על תאים מציגי אנטיגן (נגמ&quot;שים), ובכך משפרים את ההפעלה של תאים חיסוניים אשר עשוי להיות חשוב עבור הפעלה נוספת תא T 10, 11. עם זאת, על מנת להשיג מיקוד אופטימלי פרמטרים כגון מספר כמו כימיה polyanhydride, גודל, סוג של סוכר סוכר או צפיפות המשטח צריך להיות מותאם ולכן הגדלת התפוקה בשיטת ייצור לחשוף את המורכבות הקשורות במערכת כגון רב פרמטרית יהיה בעל ערך רב. בנוסף, השימוש של חלקיקים פונקציונליות אם בעלי ערך רב בתחומים נלווים אחרים של המחקר, כולל biosensing, חוסר תנועה האנזים, וזיהוי של foodbאורן פתוגנים. על ידי ניצול תיאר תפוקה גבוהה לסינתזה של פחמימות, האתגרים בסינתזה לשחזור של מולקולות פחמימות ניתן למתן. תגובות אוטומטיות מקבילים של סוכר אותו יכול לייצר כמויות גדולות יותר של החומר לפי הצורך. את התפקידים הידועים של סוכרים glycoconjugates הם המתרחב במהירות. עם זאת, הבנה של המנגנונים המולקולריים של פחמימות בתהליכים רבים, כגון התמרה מסלולים האות או תהליכים תאיים הכרה 21, מסתמך על זמינות קלה וזולה של מבנית מוגדרים היטב saccharides. הגנה / deprotection אסטרטגיות לשלוט תגובתיות של קבוצות הידרוקסיל שונות להארכת שרשרת מדויקת הם הנדרשים הממשלה לסינתזה סוכר, אך הם מייגע זמן רב. Oligonucleotides ו oligopeptides מסונתזים באופן סדיר וביעילות באמצעות סינתיסייזרים אוטומטיות 22, 23. סינתיסייזר שלב מוצק הוא אווה<html> ilable לסינתזה oligosaccharide 24, אבל סובלת מכמה חסרונות רציניים: למשל, עודפים גדולים של אבני הבניין (5 עד 20 ושווי צימוד בכל שלב), העדר מעקב קליל ההתקדמות התגובה, ואת השוני הפנימי של מוצק שלב שרפים המשמשים . הפלטפורמה החדשה פתרון שלב אוטומציה, לעומת זאת, דורש רק 2-3 ושווי של אלה אבני הבניין יקרות. במצע זה מגוון של תגים fluorous, כגון קבוצת fluorous alkenyl, מאפשרת מיצוי fluorous מוצק שלב (FSPE) לטהר את מוצרי ביניים בקלות בלתי fluorous תרכובות 18, 25, 26. עם זאת, כפי שמוצג כאן, תגיות אלה לא ימנע פתרון שלב glycosylation ותגובות deprotection בממסים אורגניים רגילים. כמו כן, בניגוד סינתיסייזר מוצק בשלב כלשהו אוטומטית, זו הפלטפורמה החדשה מאפשרת ניטור התגובה סטנדרטיים אסטרטגיות כגון ספקטרומטריית מסה (MS) ו - כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) בכל שלב. ontent &quot;&gt; כפי שתואר בסעיף תוצאות, לאחר functionalization תפוקה גבוהה של חלקיקים המוצגת כאן, התנאים התגובה (למשל, זמן התגובה ואת הטמפרטורה) כדי להשיג מורפולוגיה nanoparticle אופטימלי אחרי functionalization מוטבו. טמפרטורת התגובה אופטימלית ייתכן שתצטרך להיות מותאם בהתאם למאפייני פולימר נהגו לפברק חלקיקים (למשל, הטמפרטורה כוס המעבר (ט ז), שיעורי השפלה). לדוגמה, בעת שימוש עם פולימרים נמוך T g (מתחת לטמפרטורת החדר), התגובות functionalization תצטרך שנערך בטמפרטורות נמוכות, וזה המקרה של כמה chemistries polyanhydride מנוצל בקבוצת המחקר שלנו. אופטימיזציה של זמן התגובה הכולל מועסק functionalization החלקיקים רצוי במיוחד כאשר החלקיקים כימיה עם שיעורי השפלה שונים צריכים להיות פונקציונליות. זמן תגובה קצר יותר עשוי להיות אידיאלי כדי functionalize בתפזורת נשחק דואר חומריםבמיוחד כאשר רמת הסוכר המיקוד צריך להיות מחובר חלקיקים סמים או חלבונים טעונים. ריכוז הסוכר על פני החלקיקים עשוי להיות משתנה חשוב לכוון את הביצועים הביולוגי של ספקים אלה. התוצאה הביולוגית של שינוי ריכוז הסוכר הוא אזור הנוכחי של המחקר במעבדות שלנו. השימוש תפוקה זו גבוהה שהוקם כדי לייצר חלקיקים polyanhydride פונקציונליות מאפשר בדיקה של מספר רב של משתנים מהר יותר מאשר ייצור קונבנציונלית ושיטות functionalization. המגבלה העיקרית של הטכניקה תפוקה גבוהה הוא גודל המנה המרבי של החלקיקים ניתן להשיג מאז הוא מוגבל על ידי גודל של מכולות יכול להתאים לבעלי מכשירים: עם זאת, מאז השימוש העיקרי של קבוצה זו הוא עד להקרנה אצווה גודל קטן יותר ניתן להשתמש בצורה יעילה למטרה זו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ממונע שלב XYZ: 3x T-LSM050A, 50 מ&quot;מ נסיעות לכל ציר </td><td> Zaber טכנולוגיות </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 משאבת מזרק יחיד </td><td> חדשות משאבה עידן מערכות </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> פיירקס * Quick Vista * לשימוש חוזר ללא מסגרת צינורות זכוכית תרבות </td><td> קורנינג </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed טכנולוגיות </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> לאומי מכשירים </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE גז מזרקים צמודים, Luer לוק </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> מיני צינור מסובבי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

high-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles

גישות Transdisciplinary מעורבים בתחומים כגון עיצוב החומר, ננוטכנולוגיה, כימיה, אימונולוגיה צריך להיות מנוצל באופן רציונלי לעצב יעילים ספקי חיסונים. Nanoparticle מבוססי פלטפורמות יכול להאריך את ההתמדה של אנטיגנים החיסון, אשר יכול לשפר את החיסון immunogenicity 1. פולימרים מתכלים מספר נחקרו כמו אספקת כלי רכב חיסון 1, בפרט, חלקיקים polyanhydride הוכיחו את היכולת לספק שחרור מתמשך של אנטיגנים חלבון יציב להפעיל תאים מציגי אנטיגן לווסת את המערכת החיסונית 2-12. עיצוב המולקולרי של חיסון אלו נושאות צריך לשלב את הבחירה הרציונלית של תכונות פולימרים, כמו גם שילוב של סוכני מיקוד המתאימים. ייצור תפוקה גבוהה של מיקוד אוטומטי ligands וחלקיקים פונקציונליות הוא כלי רב עוצמה שישפרו את היכולת ללמוד r רחבange נכסים ויוביל בעיצוב של מכשירים משלוח לשחזור החיסון. תוספת של מיקוד ligands מסוגל להיות מוכר על ידי קולטן ספציפי על תאים של מערכת החיסון הוכח לווסת ואת התגובה החיסונית חייט 10,11,13 C מסוג קולטנים lectin (CLRs) הם זיהוי תבניות קולטנים (PRRs) המזהים פחמימות קיים פני השטח של פתוגנים. גירוי של תאים חיסוניים באמצעות CLRs מאפשר הפנמה משופרת של אנטיגן והצגתו לאחר מכן על הפעלה נוספת תא T 14,15. לכן, מולקולות פחמימות תפקיד חשוב במחקר של התגובה החיסונית, אולם השימוש של ביומולקולות אלה לעיתים קרובות סובל מחוסר זמינות של מבנית מוגדרת היטב ופחמימות טהורות. פלטפורמת אוטומציה מבוסס על פתרון איטרטיבי, שלב התגובות יכול לאפשר סינתזה מהירה ומבוקרת של מולקולות אלה מאתגרים סינטטי שימוש ב נמוך משמעותיתuilding כמויות לחסום יותר מוצק שלב שיטות מסורתיות 16,17. במסמך זה אנו מדווחים פרוטוקול לסינתזה פתרון שלב אוטומטית של אוליגוסכרידים כמו מנוז מבוססי ligands מיקוד עם מיצוי מוצק בשלב fluorous לטיהור ביניים. לאחר פיתוח של שיטות אוטומטיות כדי להפוך את הסוכן פחמימות המבוססת על מיקוד, אנו מתארים את דרכי ההתקשרות שלהם על פני השטח של חלקיקים polyanhydride העסקת מערכת רובוטית אוטומטית את ומופעל על ידי LabVIEW כפי שתואר קודם לכן 10. Functionalization משטח עם פחמימות הראו יעילות מיקוד CLRs 10,11 והגדלת התפוקה של שיטת ייצור לחשוף את המורכבות הקשורות במערכת רב פרמטרית יהיה בעל ערך רב (איור 1 א).

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles at JoVE.com

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Views.  Iowa State University. במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

Video: High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

סינתזה מיקרוגל מונחה של תחמוצת ברזל חלקיקים עבור איתור מהיר של טרשת עורקים

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...