המחברים מבקשים להודות נדא Naffakh ומארי אן Rameix-Welti (מכון פסטר) על וירוס rWSN-PB2-סטרפטוקוקוס.

<html> תרשים זרימה סכימטי של פרוטוקול מוצג איור. 1, לוח ריאגנטים מוצגת להלן. 1. זיהום (16 - 24 ש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע את התאים הלה 5 150 מ&quot;מ פלסטיק תרבות מנות תא בינוני שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) בגובה בינוני גלוקוז, כך שהם יגיעו כ 80% confluency למחרת (כ 5 x 10 8 תאים). חשוב כי התאים אינם מגיעים 100% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לדלל את סטרפטוקוקוס-מתויג וירוס השפעת לתוך המניה פוספט בופר סליין (PBS) המכיל 0.3% אלבומין בסרום שור (BSA) על ריבוי של זיהום של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני צמיחה מן התאים, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולהוסיף 10 מ&quot;ל PBS המכילים את הנגיף לתאים. דגירה של H 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את זיהום בינוני עם גלוקוז DMEM גבוהה, ולהמשיך הדגירה על 37 ° C. </li></ol>&quot;&gt; משך הדגירה תלוי בשלב של זיהום להיחקר (ראה דיון). 2. ההיפוך חלוקה subcellular (3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעם מקור PBS ולאחר מכן להקפיא תאים PBS קר עם מגרד גומי העברת צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה צנטריפוגות בטבלה העליונה של 5 דקות על סל&quot;ד 1000 ולאחר מכן לשאוב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 10 חיץ סוכרוז קר מ&quot;ל (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 2 מ&quot;ג mM אצטט (MgOAc), 3 מ&quot;מ CaCl 2, סוכרוז 340 מ&quot;מ, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% מעכב פרוטאז תערובת) . לאחר ההשעיה, עוברים התאים דרך עצה 200 μl פיפטה מחוברת פיפטה 10 מ&quot;ל פלסטיק סרום לשבש גושים סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 דק &#39;על הקרח. בעדינות להפוך מדי פעם כדי resuspend תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Nonidet P-40 (NP-40) לריכוז סופי של 0.5% ו מערבולת במהירות גבוהה במשך 15 שניות. מיד סרכזת דקות 10 XG ב 3500 ב 4 ° C בטבלה העליונה centrifuGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק cytoplasmic. גלולה צריך להיות קטן יותר לבן מאשר גלולה התא המקורי. שברים כל יכול להיות מאוחסן במשך שעות לפחות 4 על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה ב 5 מ&quot;ל חיץ קר סוכרוז צנטריפוגות מחדש, כמו בשלב 2.5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה (המכיל גרעינים) ב 1.5 מ&quot;ל קר חיץ החילוץ nucleoplasmic (50 HEPES ה-pH 7.9 מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;מ KOAc MgCl 2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% מעכב פרוטאז תערובת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה צונן, כל זכוכית 4 מ&quot;ל Dounce homogenizer עם העלי צמודה ו homogenize גרעינים עם 20 חבטות. הימנע קצף במהלך homogenization. ההתנגדות צריכה להגדיל לאחר כ 10 משיכות. Homogenization יעיל ניתן לאשר תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת גרעין הומוגני כדי צינור 1.5 microcentrifuge מ&quot;ל ו דגירה 20 דקות על גלגל מסתובב ב 4 °ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת על 16,000 X גרם microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק nucleoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במאגר 1.5 מ&quot;ל העיכול (50 HEPES ה-pH 7.9 מ&quot;מ, 10 mM NaCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM DTT, 1% מעכב פרוטאז לערבב, 100 יח&#39; / מ&quot;ל (Benzonase לניתוח RNA, תחליף עם 20 יח&#39; / מ&quot;ל RNase ללא DNase אני)) מראש לחמם 37 ° C, דגירה 10 דק &#39;ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 42 μl של 5 M NaCl (ריכוז סופי של 150 מ&quot;מ NaCl) ו דגירה 20 דקות נוספות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת על 16,000 X גרם microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק ch150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1.5 חיץ מ&quot;ל קר מלח גבוהה (50 mM HEPES pH 7.9, 500 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% מעכב פרוטאז תערובת) ו דגירה 20 דק &#39;על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת על 16,000 X גרם &lt;/ Em&gt; ב microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק ch500. </li></ol> 3. סטרפטוקוקוס-תג טיהור (2 ח) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של 5 M NaCl לשבר cytoplasmic (ריכוז סופי של 150 מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 aliquot μl של חרוזים ארוזים סטרפטוקוקוס-Tactin Sepharose לכל שבריר של צינור מ&quot;ל 15 חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 כרכים של חיץ לשטוף דלקת (20 mM HEPES pH 7.9, 150 מ&quot;מ NaCl (500 mM NaCl עבור ch500 דגימות), 1 mM EDTA) על חרוזים, ללא מרחב גליל לערבב, ו סרכזת 5 דקות ב 1000 x גרם השולחן סרכזת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, חזור על שלב 3.3 פעמיים ואז resuspend גלולה חרוז בנפח שווה של חיץ לשטוף דלקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של slurry שטוף חרוז סטרפטוקוקוס-Tactin לשבר כל אחד (ב -1.5 microcentrifuge צינורות מ&quot;ל עבור nuceloplasmic, ch150 ו ch500 שברים ו צינור חרוטי 15 מ&quot;ל לשבריר cytoplasmic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובבצינורות 1h ב 4 ° C על גלגל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת צינורות 1 דקות ב 1000 x גרם ב 4 ° C. מחק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל למאגר הקר לשטוף דלקת לצינור אחד. העברת החרוזים מהצינור 15 מ&quot;ל (חלק cytoplasmic) לצינור 1.5 מ&quot;ל. לשטוף את כל צינורות 1 דקות ב 4 ° C, צנטריפוגה אחרי כמו בשלב 3.7. חזור על פעולה זו פעמיים בכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הכביסה האחרונה, להסיר את כל עקבות של חיץ לשטוף באמצעות פיפטה קצה שטוח. הוסף 100 μl elution המאגר (מאגר דלקת רחצה המכיל 2.5 מ&quot;מ desthiobiotin) ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דק &#39;על הקרח. מערבבים מדי פעם בעדינות חרוזים ידי הקשה על החלק התחתון של הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגות 1 דקות ב 1000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס microcentrifuge. איסוף supernatant eluted המכילים סטרפטוקוקוס-מתוייגים vRNPs. </li></ol> 4. נציג תוצאות היעילות של חלוקה נשפט הטובה ביותר על ידי ניתוח כתם המערבי של lysates לבורסקאות באמצעות antibסמנים ספציפיים subcellular (איור 2) odies. באופן ספציפי, חלוקה subnuclear מוצלח צריך להראות מעט או ללא נייד RNA פולימראז II (POL II) nucleoplasmic, או חלק גרעינית מסיסים 4, ורוב צריך לחלץ מ&quot;מ 150 NaCl 5. השפלה של Pol II הוא גם ציין reproducibly בתאים הנגועים בווירוס שפעת לעומת תאים נגוע, עולה בקנה אחד עם הספרות 6. טיהור vRNPs נשפט הטובה ביותר על ידי כסף או מכתים Coomassie, כפי שמוצג על eluate cytoplasmic באיור. 3. מניסיוננו, רוב סטרפטוקוקוס-PB2 מטוהרים ב כחלק vRNP מלא בנוי, כלומר פולימראז מסיסים מעט הוא נתפס. הדבר בא לידי ביטוי NP גבוה: PA/PB1/PB2 יחס שנצפו על ידי כסף או מכתים Coomassie. יחס נמוך יותר מצביע על זיהום חיץ עם RNases, כמו בכל מקום RNases מספר (כגון RNase) ידועים רנ&quot;א נגיפי לדבוק בצורה כזאת כמו dissociאכלו פולימראז מ NP multimers 7. מעניין לציין, כי הטיפול Benzonase בלבד, בעוד מספיק לעכל RNA ויראלי, נראה כי אין השפעה על יחסי stochiometric של חלבונים vRNP. למרות שאנחנו לא יכולים להסביר את התופעה, צפינו שיבוש vRNPs לאחר עיכול עם RNases אחרים (מידע לא מוצג), טוען כי Benzonase יכולים להשאיר מסוימים באזורים חשובים מבחינה מבנית רנ&quot;א ללא פגע. לאחר טיהור vRNPs מן הציטופלסמה לבין nucleoplasm (שבוצעה ללא העיכול nuclease), 8 להקות קלוש אך דיסקרטית בכל המשקלים המולקולריים הגבוהים ניתן לראות על ידי צביעה כסף, אשר מתאימות את המשקולות מולקולריים החזויים של 8 קטעים הגנום שפעת (ראה השופט. 3 ). הסכומים היחסיים של vRNPs מטוהרים מן חלק זה של זיהום H 9 בהודעה מוצגים בתרשים. 4. חלוקת vRNPs משתנה במהלך זיהום, עם הצטברות החזק ביותר בשבריר ch150 בנקודות זמן המוקדמות,הצטברות מוגברת nucleoplasm ו הציטופלסמה בנקודות זמן המאוחרות. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. תרשים זרימה תרשים של חלוקה subcellular. מעובד מתוך REF. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. ניתוח המערבי כתם של שברים subcellular משפעת הווירוסים נגוע תאים. 10 9 תאים הלה נדבקו WSN נגיף השפעת המתח על 9 שעות לפני חלוקה subcellular. כמויות שוות של חלבון הכולל הועמסו בנתיב זה ונותחו באמצעות נוגדנים המוצגים. RNA פולימראז II (POL II) זוהה באמצעות שיבוט 8WG16, אשר מכיר את כל צורות תחום בטרמינל C-(הלהקה hypophosphorylated הוא הבולט ביותר). מעובד מתוך REF. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3.ניתוח כתם כסף מטוהרים vRNPs. תאים הלה נדבקו rWSN (כביקורת שלילית) או rWSN-PB2-דלקת של 9 שעות, ואחריו טיהור דלקת של חלק cytoplasmic. הכוכבית מציינת להקות שאינם גלויים לאחר עיכול RNase. מעובד מתוך REF. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. ניתוח כתם כסף של vRNPs מטוהרים מן שברים סלולריים שונים. 10 9 תאים הלה נדבקו rWSN-PB2, דלקת או rWSN עבור 9 שעות לאחר מכן חלוקה subcellular וטיהור דלקת. כמויות שוות של כל חלק מן eluate הועמסו. מעובד מתוך REF. 3.

<ol>
	<li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II.">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li><li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes.">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329 (2005).</li><li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell:+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure.">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li><li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin.">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II.">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li><li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins.">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li><li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle.">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).</li><li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בעוד שמחקרים רבים זיהו לאחרונה חלבונים בודדים או רשתות הסלולר המעורבים זיהום בנגיף שפעת 8, משמעות תפקודית של רוב האינטראקציות הללו עדיין לא ברור. לאור התלות המוחלטת של הכרומטין מבוססי פונקציות עבור סינתזה שפעת RNA וירוס הטבע biophysical ו ביוכימיים מורכבים של גרעין <s...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM גבוהה גלוקוז </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> מעכב פרוטאז Mix G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> 25 U / μl </td></tr><tr><td> DNase אני, RNase ללא </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / μl </td></tr><tr><td> Dounce homogenizer </td><td> ויטון </td><td> 432-1271 </td><td> השתמש להקליד &quot;B&quot; העלי </td></tr><tr><td> סטרפטוקוקוס-Tactin Sepharose </td><td> רשות השידור בע&quot;מ </td><td> 2-1201-025 </td><td> 50% טור בפורמט ההשעיה יכול לשמש גם </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> רשות השידורGmbH </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

כמו כל הווירוסים שלילי גדיל RNA, הגנום של נגיפי שפעת ארוז בצורה של מתחמי ribonucleoprotein נגיפיים (vRNP), שבו הגנום חד גדילי הוא encapsidated ידי nucleoprotein (NP), הקשורים עם מורכבות פולימראז trimeric המורכב של הרשות הפלסטינית, PB1 ו PB2 יחידות משנה. עם זאת, בניגוד לרוב וירוסים RNA, נגיפי שפעת לבצע סינתזה של רנ&quot;א נגיפי בגרעין של תאים נגועים. מעניין לציין, סינתזה mRNA ויראלי עושה שימוש הסלולר מראש mRNAs כמו primers, והוא הוצע כי תהליך זה מתרחש על הכרומטין 1. יחסי הגומלין בין פולימראז ויראלי המארח RNA פולימראז II, כמו גם בין NP ו nucleosomes המארחות יש גם לאפיין 1,2. לאחרונה, דור של נגיפי שפעת רקומביננטי קידוד אחד סטרפטוקוקוס-Tag התמזגו גנטית הסופית-C של למקטע PB2 של פולימראז ויראלי (rWSN-PB2-סטרפטוקוקוס 3) יש להיותen תיאר. אלה וירוסים רקומביננטי לאפשר טיהור PB2 המכילים קומפלקסים, כולל vRNPs, מן התאים הנגועים. כדי להשיג מטוהרים vRNPs, בתרביות תאים נגועים, ו vRNPs הם זיקה מטוהרים מן lysates שמקורם בתאים אלה. עם זאת, ההליכים תמוגה בשימוש עד כה התבססו על צעד אחד תמוגה חומרי ניקוי, אשר, למרות נוכחותם של nuclease כללי, פעמים רבות לחלץ הכרומטין החומר הנכנס רק לא יעיל. עבודה ראשונית שלנו הראו כי חלק גדול vRNPs גרעיני לא הופקו במהלך תמוגה התא המסורתי, ולכן לא יכולה להיות זיקה מטוהרים. כדי להגביר את יעילות מיצוי, וכדי להפריד הכרומטין, חייב מן הלא הכרומטין הנכנס vRNPs גרעיני, התאמנו את פרוטוקול צעד חכם החילוץ subcellular שפעת הווירוסים נגוע תאים. בקצרה, הליך זה 1 מפריד הגרעינים מהתא ואז מוציא חלבונים גרעיניים מסיסים (שמכונה כאן חלק &quot;nucleoplasmic&quot;).החומר הנותר גרעינית מסיס מתעכל אז עם Benzonase, נוקבים DNA / RNA nuclease, ואחריו שני צעדים תעשיית מלח: 1 משתמש 150 מ&quot;מ NaCl (המכונה &quot;ch150&quot;), ואז NaCl 500 מ&quot;מ (&quot;ch500&quot;) (איור 1 ). מיצוי הפעולות הבאות מלח נבחרו בהתבסס על תצפיות שלנו 500 מ&quot;מ NaCl היה מספיק כדי solubilize מעל 85% vRNPs גרעיני אך עדיין לאפשר המחייב של vRNPs מתוייגים למטריצה ​​את הזיקה. לאחר חלוקה subcellular של תאים נגועים, אפשר vRNPs זיקה לטהר PB2-מתוייגים של חלק בנפרד ולנתח את החלבון שלהם ואת מרכיבי רנ&quot;א באמצעות כתם המערבי והרחבה פריימר, בהתאמה. לאחרונה, השתמשנו בשיטה זו כדי לגלות בצורה מתחמי vRNP הייצוא במהלך נקודות המאוחרות לאחר ההדבקה על חלק הכרומטין חילוץ עם 500 mM NaCl (ch500) 3.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells at JoVE.com

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ&quot;א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Views.  Universitätsklinikum Freiburg. נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

Video: Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...