המחברים מבקשים להודות לכל חברי הקונסורציום SSGCID. השגת היעדים של SSGCID מתאפשרת על ידי המאמצים הכבירים של כל חברי צוות באמרלד ביו. מחקר זה מומן בHHSN272200700057C מספר החוזים פדרלי מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומי לבריאות ומחלקת בריאות ושירותי אנוש.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

הכותבים הם עובדים של אמרלד ביו, Inc

עיבוד מקביל רב יעד תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בגילוי תרופות. SSGCID מחויבת לספק לקהילה המדעית עם מבנים חלבוניים תלת ממד מפתוגנים NIAID הקטגוריה AC. הפיכת מידע לזמין לציבור רחב כגון מבני תשמש סופו של דבר להאצת תכנון תרופות המבוסס על מבנה. הצעד הקריטי הראשון של גישת MTPP הוא עיצוב מבנה. בונה מרובות של כל חלבון המטרה מגדילה את ההסתברות של קביעת מבנה מוצלחת ותפנית עליות. זה בלתי נמנע שכמה מבני חלבונים ייכשלו במהלך שלבים שונים של הצינור. יישום שיטת שיבוט PIPE תומך בשיטת MTPP כך שהוא מאפשר את הדור של מבנים רבים בתבנית 96, גם ללא צעדי טיהור עתירי עבודה. שיוך שיבוט צינור עם היכולת לנתח ביטוי חלבון באותה מתכונת 96, גם (Caliper המעבדהשבב 90) עוד יותר מזרז את הזרימה הכוללת. הזיווג של שיטות אלה מאפשר זיהוי מהיר של מבנים המייצרים חלבון מסיס אשר מבטיח את ההצלחה של ייצור חלבון בקנה מידה גדול וטיהור. היבט חיוני להצלחה של התפוקה גבוהה MTPP הוא אמצעים לחלבון (פטנט אמריקאי מס 6,818,060, אמרלד ביו) מכשיר. אמצעים לחלבון הוא מערכת כרומטוגרפיה נוזלית במקביל ערוץ 24 שפותחה במיוחד כדי להגביר את היעילות של ייצור חלבון תפוקה גבוהה ויישומי מחקר הגנומי צינור המבני בנושא. באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן להכנת החלבון, היתרונות ניכרים בהשוואה למערכת FPLC שורה אחת. אדם אחד יכול לטהר עד 48 מטרות במקביל בתוך תקופה של שמונה שעות ביממה. בניגוד לכך, אדם יחיד באמצעות מערכת FPLC שורה אחת יכול רק לטהר את מקסימום של ארבע מטרות בתוך פרק הזמן זהה. הרמות הגבוהות של טוהר לכל יעדלהשיג עם אמצעים לחלבון הם גורם קריטי בהצלחה בהמשך של גבישי חלבון גוברים לניתוח מבנה. מגבלות ופתרון בעיות פתרון מבנים תלת ממדי על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן הוא מאמץ רב מבוים עם אתגרים רבים, שאחד מהם הוא חוסר היכולת להשיג כמויות גדולות של חלבון המטרה מסיס. אסטרטגיה אחת שיכול להיות מיושמות כדי להתגבר על הבעיה המסיסות היא השימוש בביטוי מארח כחלופת א &#39; קולי תאים אינכם מצליחין לבצע כמה שינויים לאחר translational אוקריוטים חשובים. ביטוי בשמרים שונים, שורות תאי חרקים ויונקות, כי הם מסוגלים לבצע לאחר translational השינויים הללו הם לעתים קרובות חלופה מתאימה. חלבוני יעד לפעמים באים לידי ביטוי אך לא מסיס לחלוטין בתנאי תמוגה הסטנדרטיים. אמצעים לחלבון יכול להיות משאב יקר ערך עבור הבדיקה המהירה של תנאי תמוגה תא חלופייםכפי שמתואר בסמית et al. 2011 13. אסטרטגיה זו היא לעתים קרובות הכרחית כדי לשמור על מטרות נעות דרך הצינור. בכל צינור גנומיקה מבני, פרוטוקולים סטנדרטיים לא יכולים להיות מתאימים לכל יעד שמגיע דרך הצינור ומטרות עשויות להזדקק לאופטימיזציה של פרט. לדוגמה, בחרו להשתמש 20% אתילן גליקול לכל cryoprotectant. במקרים שהמצב הזה הוא לא מתאים, או ריכוזי cryoprotectants החלופיים ייתכן שיצטרכו להיבדק. בשל האופי הייחודי של כל יעד חלבון בודד, שער הגבלת וצעד בלתי צפוי בקביעת מבנה הוא התגבשות. את קיזוז צינור MTPP שיעור ההצלחה הנמוך בדרך כלל מהתגבשות חלבון עם אופטימיזציה ממסכי המטריצה ​​הדלילות הראשוניים. כל גביש ראשוני נפגע ממסכי מטריצה ​​דלילים זמינים מסחרי הוא מותאם יותר עם בונה דואר מסך (אמרלד ביו). לאופטימיזציה של המסך נועד ARound מצבו של להיט הגביש הראשוני, לשנות את הריכוזים של המאגרים, המלחים, ותוספים. מסכי אופטימיזציה מוצלחות להניב גבישים המתאימים לעקיפים מחקרים וקביעת מבנה. תכנית גנומיקה המבנית אשר נקבעו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מספקת מימון לאמרלד ביו ושלושה מוסדות מערב האוקיינוס ​​השקט אחרים שיחד הם SSGCID (אמרלד ביו, SeattleBiomed, אוניברסיטת וושינגטון וPacific Northwest National Laboratory) . כל אחד מחברי הקונסורציום נבחר למומחיות שלהם ביישום טכנולוגיות מדינה-of-the-art הנדרשות להשגת המטרות של תכנית גנומיקה המבנית NIAID. נכון להיום, SSGCID הפקידה 461 מבנים לדירוג PDB כתורם הגדול ביותר השביעי בעולם, ובשנת 2011, הפורה ביותר. הפרוטוקולים ומתודולוגיות של SSGCID מסופקים עם הכוונה לטובתקהילה מדעית ומנציח את המחקר במחלות זיהומיות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

התפרצויות מגיפה של זני שפעת אלימים ביותר יכולות לגרום לתחלואה ותמותה נרחבות באוכלוסיות אדם ברחבי העולם. בארצות הברית בלבד, ממוצע של 41,400 מקרי מוות ו 1.86 מיליון אשפוזים נגרמים על ידי זיהום בנגיף שפעת בכל שנה 1. מוטציות נקודתיות בחלבון למקטע 2 הבסיסי פולימראז (PB2) נמצאו קשורה להסתגלות של הזיהום הנגיפי בבני אדם 2. ממצאים ממחקרים כאלה גילו את המשמעות הביולוגית של PB2 כגורם ארסיות, ובכך מדגישים את הפוטנציאל שלה כיעד תרופה אנטי. תכנית גנומיקה המבנית אשר נקבעו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מספקת מימון לאמרלד ביו ושלושה מוסדות מערב האוקיינוס ​​השקט אחרים שיחד מרכיבים את מרכז ג&#39;נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות (SSGCID). SSGCID מחויבת לספק לקהילה המדעית עם threמבנים חלבוניים דואר ממדי של פתוגנים NIAID הקטגוריה AC. מה שהופך את המידע כזה מבני זמין לקהילה המדעית משמש להאצת תכנון תרופות המבוסס על מבנה. תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי להוביל חדש על ידי מיקוד מסלול או משפחת חלבון כולו. אמרלד יו פיתחה צינור עיבוד מקביל תפוקה גבוהה, רב יעד (MTPP) להגדרת גן למבנה כדי לתמוך בקונסורציום. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים כדי לקבוע את המבנה של מקטע PB2 מארבע זני שפעת שונה.

את התוצאות הבאות להמחיש את התוצאות הצפויות של הפרוטוקול המתואר, ובמקרה של PB2, את התוצאות שנצפו. באמצעות מלחין ג&#39;ין, חמישה רצפים של חומצות באורך מלא היעד של אמין PB2 מקטע פולימראז נגיף השפעת נועדו (איור 2). את PB2 הרצפים תורגמו בחזרה ונתונים לצעדים רבים הנדסי 3, וכתוצאה מהרצפים ההרמוניים קודון המותאמים לביטוי בE. coli. ממוצרי iPCR (איור 3), סך של שלושים וארבעה מבנים היו משובט בהצלחה למערכת וקטור pET28 שונה 10 עם N-מסוף 6x תג ההיתוך שלו-SMT באמצעות שיבוט PIPE 3, כפי שמוצג באיור 3 א. סיכום של העבודה השיבוט מוצג באיור 4. אחרי שיבוט מוצלח, ביטוי חלבון בקנה מידה מייקרו של כל מבנה נבדק בBL21 (DE3) א &#39;קולי תאים. תאים גודלו במדיום שחפת בתוספת 1 בינונית Novagen לילה Express (על פי הפרוטוקול של היצרן) עבור 48 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בסט רועד חממה ב 220 סל&quot;ד. לאחר צמיחה, תאים נקצרו ונבדקו לביטוי חלבון מסיס באמצעות electrophoreses הנימים עם LabChip Caliper 90. ארבעה עשר מהשלושים וארבעה המבנים PB2 הובילו לחלבון המטרה מסיס ונכנסו תסיסה בקנה מידה גדולה. תרבויות בקנה מידה גדולה של כל אחד מהמושגים שגדלו במדיום שחפת בתוספת בינונית אקספרס לינה של Novagen 1 על פי הפרוטוקול של היצרן. לאחר צמיחה, תאים נקצרו באמצעות צנטריפוגה ומאוחסנים ב -80 ° C. ביטוי חלבון בקנה מידה גדול של כל תרבות ותרבות אישר באמצעות SDS-PAGE ניתוח (איור 5) לפני שימשיך עם טיהור בקנה מידה גדולה. אמצעים לחלבון שימש לביצוע טיהור מקבילה של הארבעה עשרה מבני PB2. את lysates הבהיר של אלמבני ליטר ארבעה עשר היו לרוץ דרך עמודת ניקל chelate. לאחר הקביעה שהכיל שברי חלבון המטרה על ידי-SDS, שברים המקבילים היו נקווה לכל דגימה והריכוז של כל אחד נקבע על ידי קריאה 280. ההסרה של תגו-SMT 6x נערכה על ידי התוספת של ULP1 אחרי דיאליזה הלילה ועמודה שנייה ניקל. אישור על הסרתו התג-SMT נערך על ידי-SDS (איור 6), ומדגם זה היה מרוכז עם צינור צנטריפוגות אולטרה 10 kDa Amicon. לאחר ריכוז באמצעות צינורות צנטריפוגה Ultra Amicon, כל דגימה נדרסה עמודה אומדת להשיג טוהר קריסטלוגרפיים. ריכוז שני נערך להגדיל את ריכוז החלבון לרמה הכרחית להתגבשות. כל ארבע עשרה המבנים היו מטוהרים בהצלחה ונכנסו לתוך ניסויי התגבשות. הגיבוש נערך ביוזמת הפשרת FR בעברחלבון אוזן. הגיבוש נערך בחדר מבוקר אקלים על 16 מעלות צלזיוס עם צלחות, שתוכננו במיוחד (אמרלד ביו) לישיבת דיפוזיה אדי טיפה (איור 7). סינון ראשוני נערך עם ארבעה מסכי דלילים-מטריקס; JCSG +, ברית, אשף מלא, וCryoFull (אמרלד ביו), בעקבות אסטרטגיית ניומן מורחבת. 0.4 μl של תמיסת חלבון היה מעורב אז עם 0.4 μl של crystallant (או פתרון מאגר) מהמאגר המקביל באמצעות צלחות התגבשות ג&#39;וניור 96, גם קומפקטיות (אמרלד ביו). מהארבעה עשר הדגימות מטוהרות תשעה מהם הניבו גבישים מתאימים ללימודים עקיפה (איור 8). ערכת נתונים עקיפה בבית נאספה בחמישה מתוך תשעת המבנים התגבשו בCu Kα אורך הגל באמצעות גנרטור Rigaku superbright FR-E + מסתובב-האנודה רנטגן המצויד Osmic VariMax אופטיקה HF ו 944 + גלאי CCD שבתאי (איור 9 ). כל סט הנתונים מעובד עם XDS / XScale 4 &lt;<html> / Sup&gt; וטפס להחלטה סופית. ניסיונות לפתור את המבנים על ידי החלפה מולקולרית בוצעו עם Phaser 5 מCCP4 חבילת 7. הדגמים הסופיים התקבלו לאחר העידון בREFMAC 7 ובנייה מחדש ידנית עם 11 הקרסול. המבנים הוערכו ותיקן לגיאומטריה וכושר עם MolProbity 9. כוללת של ארבעה מבנים של מקטע PB2 נקבעו (איור 10) והופקד לPDB. איור 11 מדגים את התוצאה הכללית בכל שלב בצנרת MTPP. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של מסלול גן למבנה SSGCID לעיבוד מקביל מרובה היעד באמרלד ביו. <html> תוכן &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> איור 2. מציג יישור וחלבון לבנות מודול עיצוב בתוכנת מלחין ג&#39;ין. בסיס חומצה אמינית לבנות של היעד מוצג בירוק (חלון באמצע) ואת truncations מודרך המבנה של מבנים חלופיים מוצגות בזהב (חלון תחתון). יישור של רצפים נגיפיים שפעת PB2 מרובים מוצג בהשוואה לרצף ואלמנטי מבנה משניים של התחום בטרמינל C-מ3CW4 PDBID. ידע של מבנה התחום ואלמנטי מבנה משניים מאפשר truncations N-מסוף להיבחר בתוך מודול עיצוב מלחין הגן על ידי לחיצה ימנית על שאריות חומצת אמינו הרצויה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> ithin עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3 א" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3a.jpg" /> איור 3 א. שיבוט צינור מאויר בי להכניס את הגן הסינטטי (כתום) מוגבר על ידי תוכנן קדימה (קווים אדומים כתומים) ופריימרים (קווים כחולים, כתום) הפוכים כדי ליצור להכניס חומר PCR. וקטור הביטוי מוגבר עם קווים הפוך (אדומים שחורים פריימרים) וקדימה (קווים כחולים שחורים) כדי ליצור חומר PCR וקטור. מוצרי iPCR רצפי מסופים משלימים לרצפי הטרמינל של מוצרי vPCR (האדום של iPCR משלים אדום של vPCR והכחול של iPCR משלימים כחולים של vPCR). זה מאפשר את מוצרי iPCR וvPCR כדי לחשל כדי ליצור פלסמידים שמשוכפלים על הפיכתו מארח BL21 (DE3) א &#39;כימי המוסמכת קולי תאים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> איור 3. ניתוח agarose ג&#39;ל של iPCR produc<html> כישלונות iPCR ts ממקטע PB2. ניתן לראות להקות חלשות או מוכתמות, ואילו מוצרי iPCR מוצלחים מיוצגים על ידי להקות חזקות. איכות מוצר בדרך כלל iPCR יכולה להיות מתואמת עם הצלחה שיבוט. סמני משקל מולקולריים הם בkiloDaltons. איור הוא לשכפל מריימונד et al., 2011 12. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> איור 4. צעדי הנדסה גנטיים של חלבוני היעד PB2 בוצעו באמצעות תוכנת מלחין ג&#39;ין. לאחר רצף חומצות הגרעין המהונדס הוקם עבור כל יעד, מבני חלבונים חלופיים 6-7 נועדו לכל אחד. עיבוד מקביל רב היעד בשלבים הראשוניים של עיצוב גן והביא לשיבוט 34 מבנים, 14 מהם היו מטרות קיימא שמיוצרות חלבונים מסיסים בE. coli. <html> מחדש 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. SDS-PAGE ניתוח נציג של תסיסה בקנה מידה גדולה מראה ביטוי חלבון חזק (גודל צפוי של 25.76 KDA), מחשוף בערך 50% מסיס (מסלול 4) וכ -50% מתג שלו 6x-SMT מחלבון eluted (מסלול 7). <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> איור 6. תוצאות-SDS לשלושה מבנים של מקטע PB2 פולימראז 1 ליין, סמנים מולקולרי משקל (מסומן בצד השמאל בKDA); נתיבים. 2, 6, ו -10, חלבון ונקווה מעמודת ניקל 1; 3 נתיבים, 7 ו 11, זרימה דרכו של חלבון ביקע במאגר מניקל 2; נתיבי 4, 8, ו -12, הסרת התג 6x-SMT בB החיץ מניקל 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. סכמטית של דיפוזיה אדים בשיטת הטיפה יושבת. שיטת הטיפה יושבת להתגבשות חלבון נופל תחת הקטגוריה של דיפוזיה האדים. שיטה זו כרוכה במדגם של חלבון מטוהר ונמהר כדי לאזן עם מאגר גדול יותר המכיל תנאים דומים בריכוז גבוה יותר. כמו מים מאדים ממדגם החלבון וההעברות למאגר, הריכוז נמהר מגביר לרמה אופטימלית להתגבשות חלבון. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> איור 8. גביש חלבון של מקטע פולימראז PB2 מזן של נגיף השפעת. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> איור 9. תמונת השתברות קרן ה-X של המקטע מפולימראז PB2זן של נגיף השפעת. <img alt="איור 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> איור 10. דיאגרמות של רצועת הכלים של המולקולות ביחידה אסימטרית קריסטלוגרפיים של 4 PB2 מבני מבנים משניים. צבעוניים בדפוס קשת עם קודי PDB מתאימים. (א) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (ב) 3KHW (/ מקסיקו / InDRE4487/2009/H1N1) (ג) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (ד) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="איור 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> איור 11. ניתוח תוצאות למטרות שפעת PB2 על ידי השיטות שתוארו. structurצינור נחישות הדואר בא לידי ביטוי בחמישה שלבים: שיבוט, מסיסות, טיהור, התגבשות מבנה ונחישות.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג&#39;נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

multi-target-parallel-processing-approach-for-gene-to-structure

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Views.  Emerald Bio. תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

Video: Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...